多肽在病毒感染性疾病中的研究进展.pdf

综述多肽在病毒感染性疾病中的研究进展王春芳,韩一芳综述,汪春晖审校 摘要 近二十年来,世界卫生组织(WHO)将多次新发和再发的病毒性传染疫情列为“全球突发公共卫生事件”。安全高效的抗病毒药物在重大传染病疫情防控中尤为重要。多肽药物由于其特异性好、毒性低安全性好、易于化学修饰等特点,其在抗病毒中具有广阔的应用前景。文章就多肽在病毒感染性疾病中的研究现状进行综述。关键词 多肽;病毒感染性疾病;抗病毒药 中图分类号 R373 文献标志码 A 文章编号 2097-2768(2024)01-0093-05 DOI 10.16571/ki.2097-2768.2024.01.017基金项目:军队后勤科研计划项目(BLB23J017G)作者单位:211100 南京,南京医科大学公共卫生学院(王春芳);210002 南京,东部战区疾病预防控制中心(韩一芳、汪春晖)通信作者:汪春晖,E-mail:13912966353 Research progress of polypeptides in viral infectious diseasesWANG Chunfang1,HAN Yifang2 reviewing,WANG Chunhui2 checking(1.School of Public Health,Nanjing Medical University,Nanjing 211100,Jiangsu,China;2.Center for Disease Control and Prevention of Eastern Theater Command,Nanjing 210002,Jiangsu,China)Abstract For nearly two decades,there have been multiple emerging and re-emerging viral infectious disease epidemics clas-sified by the World Health Organization(WHO)as global public health emergencies.Safe and efficient antiviral drugs are particu-larly important in the prevention and control of major infectious diseases.Due to its good specificity,low toxicity,good safety and easy chemical modification,polypeptide drugs have broad application prospects in antiviral.This article reviews the research status of poly-peptides in viral infectious diseases.Key words peptides;viral infectious diseases;antiviral agents0 引 言 病毒感染性疾病长期以来严重威胁人类的健康和生命,疫苗的研究诞生和抗病毒药物的应用使天花被消灭,乙型脑炎等病毒感染性疾病发病率大幅下降。但病毒性肝炎、出血热、狂犬病等仍然广泛存在,同时,艾滋病、传染性非典型肺炎、中东呼吸综合征、H7N9 禽流感、埃博拉出血热等新发感染病不断出现,特别是新型冠状病毒的出现,使得抗病毒类药物的研发推上了热潮。由于针对病毒的相关疫苗及药物研发周期长,且易因病毒变异而失效,目前大多数病毒性疾病缺乏特效的治疗药物。多肽药物因其独特的生化特性在抗病毒治疗中的应用前景,日益引起人们的关注。本文主要就多肽在病毒感染性疾病中的研究现状作一综述。1 多肽的简介 肽一般由 250 个氨基酸残基组成,其中 210个氨基酸组成的肽属于寡肽,1150 个氨基酸组成的肽属于多肽,分子量介于小分子和蛋白质之间。多肽分为天然肽和合成肽,天然肽可从动物、植物、微生物中直接提取,合成肽可通过重组技术、固相合成法、-氨基酸-N-羧基内酸酐法、碳酸二甲酯两步法、N-甲氧酰基氨基酸直接靶向脱羧合成法等方法人工合成。此外,多肽还通过自组装作为各种治疗药物的输送载体。多肽药物具有生物活性高、免疫原性低、特异性好、组织渗透性好、毒性低安全性好、易于合成和修饰、不易在组织中蓄积等特点。自1921 年合成第一个治疗性肽胰岛素以来,伴随着结构生物学、重组生物制剂和合成和分析技术的进步,多肽类药物的研发已成为药物研究的热点之一。39医学研究与战创伤救治2024 年1 月 第37 卷 第1 期 J Med Res Combat Trauma Care,Vol.37,No.1,January,20242 多肽的抗病毒作用 目前,抗病毒药物主要可分为核苷类似物、蛋白酶抑制剂、免疫调节剂,通过抑制病毒复制、抑制病毒侵入细胞、增强机体免疫力等方面来治疗病毒感染。但由于现有抗病毒药物不良反应以及耐药性病毒突变体的产生,抗病毒新药及新疗法的研发尤为重要,近年来多肽类物质的抗病毒作用引起了广泛关注。抗病毒肽通过不同作用机制展现出强有效的抗病毒作用,且对包膜病毒和非包膜病毒均具有抗病毒活性。根据已知的病毒蛋白结构及其细胞靶点,可合理设计和优化不同靶定区域、不同长度的抗病毒多肽,所合成的多肽对靶点具有高度特异性,通过筛选得到对特定的病毒病原体具有广泛抗病毒活性的多肽。2.1 抗包膜病毒2.1.1 抗新型冠状病毒多肽严重急性呼吸综合征冠状病毒 2(severe acute respiratory syndrome coro-navirus 2,SARS-CoV-2)是一种包膜正义单链 RNA病毒,病毒基因组编码四种主要的结构蛋白,刺突蛋白 S(spike protein)、N 蛋白(nucleocapsid protein)、M蛋白(membrane protein)和 E 蛋白(envelope pro-tein)。S 蛋白介导病毒与宿主细胞膜之间以及感染细胞和邻近未感染细胞之间的附着和融合,是冠状病毒感染细胞的核心蛋白。虽然现有疫苗接种有一定的控制感染和重症的作用,但由于 SARS-CoV-2突变体的快速迭代,而无法提供长期的有效保护。目前研究的抗新冠病毒多肽作用方式主要体现在以下几个方面:多肽可通过靶向 S 蛋白中的宿主细胞受体结合域(receptor binding domain,RBD)来抑制其与宿主血管紧张素转换酶 2(angiotensin conver-ting enzyme 2,ACE2)的结合进而抑制病毒的感染。有研究报道,由人肠道潘式细胞分泌的防御素 5(human defensin-5,HD5)可通过靶向宿主 ACE2,抑制其与 S 蛋白的 RBD 结合,进而减少 SARS-CoV-2侵入细胞1;Beddingfield 等2发现纤连蛋白衍生的多肽 ATN-161,可能通过与整合素 RGD 基序(argi-nine glycine aspartate sequence)附近位点的结合抑制整合素 51-S 和蛋白 RBD 复合物的形成,从而抑制病毒感染。此外,一种由人气道上皮细胞产生的天然肽 LL-37 与 S1RBD 结合,也具有抑制 SARS-CoV-2 假病毒颗粒感染的潜能3。2020 年 4 月初,研究者首次探索口服 LL-37 抗 COVID-19 的初步疗效,入组的 11 例轻型患者,对该药均具有较好的耐受性、依从性,服药后未出现不良反应,消化道和全身症状改善尤为显著4。随后研究表明,LL-37可阻断 SARS-CoV-2 刺突蛋白和宿主受体 ACE2 的结合,限制 SARS-CoV-2 感染3。但是由于患者数量少,临床证据不足。为进一步评估口服 LL-37 的有效性并证明其对 Omicron 的确切治疗效果,Zhao等5进行了一项临床试验,研究中共纳入 238 例轻度奥密克戎 BA.5 感染住院患者(129 例接受口服LL-37,109 例口服接受乳酸杆菌,发现口服 LL-37 有较高的安全性,而且早期口服 LL-37 进行干预治疗效果更好,具有对抗 SARS-CoV-2 其他突变体的应用前景。多肽以激活 S 蛋白的水解酶弗林蛋白酶(furin)和跨膜丝氨酸蛋白酶 2(TMPRSS2)为靶向,是治疗 SARS-CoV-2 的另一种策略。有研究发现使用弗林蛋白酶抑制剂 CMK(decanoyl-RVKR-chlo-romethylketone)和 MI-1851 可消除 furin 的裂解,抑制 SARS-CoV-2 感 染 哺 乳 动 物 细 胞6-7。Bestle等6测试发现拟肽抑制剂 MI-432 及其类似物 MI-1900 可以通过抑制 TMPRSS2 复制阻断病毒感染人呼吸道上皮细胞。多肽的设计可以计算机分析技术作为辅助工具,针对病毒生命周期的各个阶段设计强效 SARS-CoV-2 抑制剂。有计算机辅助药物设计发现 SARS-CoV 和 SARS-CoV-2 的 S2 具有序列高度相似性8,表明有效阻断 SARS-CoV 的多肽也可能抑制 SARS-CoV-2 感染,为治疗 SARS-CoV-2 提供了新思路。2.1.2 抗人类免疫缺陷病毒多肽获得性免疫缺陷 综 合 症(acquired immunedeficiency syndrome,AIDS)简称艾滋病,由人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)感染引起。HIV 是一种具有包膜的正链 RNA 病毒,其膜表面嵌有外膜糖蛋白(gp120)和跨膜糖蛋白(gp41)。在 HIV-1 感染靶细胞的过程中,gp120 与细胞表面的 CD4 受体和CXCR4 或 CCR5 共受体结合,触发 gp41 的构象变化。目前针对 HIV 的多肽设计主要是 HIV 进入抑制剂。HIV 进入抑制剂通过靶向病毒表面蛋白或宿主细胞受体来阻断病毒与宿主细胞的融合或阻断病毒进入宿主细胞。Bashir 等9研究发现人类血红蛋白 a 衍生肽的类似物 HbAHP-25 直接作用于 gp120,抑制其与 CD4 结合,微摩尔水平即可抑制 HIV-1 感染;Cimbro 等10关于硫酸化 V2 模拟肽抑制 HIV-1进入和融合的报道,为针对 HIV-1 的治疗和疫苗设计的策略提供了线索;Wang 等11的研究结果表明,来源于 HIV 包膜蛋白(Env)胞内区的 F9170 可靶向HIV 包膜蛋白胞内区的 LLP1 结构域,破坏病毒膜的完整性,使得 HIV 基因组释放,失去感染能力。49医学研究与战创伤救治2024 年1 月 第37 卷 第1 期 J Med Res Combat Trauma Care,Vol.37,No.1,January,2024恩夫韦肽(Enfuvirtide)是目前唯一经 FAD 批准用于治疗 HIV 的多肽类药物。尽管 FDA 批准的抗 HIV肽数量有限,但是很多肽类药物已经进入临床研究阶段,如西夫韦肽(临床试验)和阿达帕韦(临床试验),基于肽的 HIV 进入抑制剂比抗体成本更低,并且比小分子化合物具有更高的特异性12。2.1.3抗流感病毒多肽流感病毒(influenza vi-rus,IV),属于正黏病毒科,根据核蛋白和基质蛋白抗原性的不同,可分为甲、乙、丙、丁 4 种亚型,其中甲型流感病毒(infuenza A virus,IAV)因其常见的抗原飘移和抗原转变而易引起大流行。IAV 为单链负链 8 节段 RNA 包膜病毒,分别编码聚合酶 B1(PB1)、聚合酶 B2(PB2)、聚合酶 A(PA)、血凝素(HA)、核蛋白(NP)、神经氨酸酶(NA)、基质蛋白(M)、非结构蛋白(NS)。病毒包膜由植物血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)和质子通道(M2)组成,病毒的核心由核蛋白(NP)和 RNA 依赖的三聚体RNA 聚合酶组成,该聚合酶又包括三个 P 蛋白(PB1、PB2 和 PA),目前抗流感病毒多肽药物主要以 HA、NA、PB1 和 M2 为靶标。最近 Reyes-Barrera 等13观察到,天然和合成EB(entry blocker)肽可通过干扰宿主膜糖蛋白的唾液酸(SA)与 HA 的结合,抑制病毒复制(IC50分别为 20.7 nM、754.4 nM),且天然 EB 肽对 IAV 流感蛋白的抗病毒效力是合成肽的 32 倍。Chen 等14发现具有低溶血活性、低细胞毒性和良好药代动力学特性的 errKPAQP(P2)对 NA 具有较强的亲和力,能够减少流感病毒诱导的炎症,并最大限度地降低感染小鼠的死亡率。有实验表明 PB1-0 肽可通过阻断 PA-PB1 间的相互作用进而抑制病毒复制15。Martyna 等16研究发现 M2AH 可通过改变 M2 蛋白结构,引起病毒膜的变形,中和流感病毒的毒性,从而阻止传播。目前针对流感病毒包膜和宿主细胞吸附以及整个 RNA 复制过程的多肽药物在研,但尚未上市,这些多肽药物潜在效能有待进一步验证。2.1.4 抗其他包膜病毒 针对丙型肝炎病毒(hep-atitis C virus,HCV)的合成肽波西普韦(Boceprevir)和特拉匹韦(Telaprevir),于 2011 年获得 FDA 批准,这些肽作用于 HCV 的 NS3/4,干扰病毒的复制17;来源于两栖类抗微生物肽的 HS-1 能破坏病毒衣壳从而对抗登革热病毒18;依赖于人源细胞发现人 Claudin 衍生肽 CL7.1(claudin-7)和 CL1.1(claudin-1)可阻断寨卡病毒的膜融合过程,也是广泛的黄病毒抑制剂19。2.2 抗非包膜病毒目前研究的抗病毒多肽活性主要依赖于破坏病毒包膜的特性,而对于非包膜病毒,多肽的研发主要基于直接与非包膜病毒衣壳相互作用而产生抑制作用。有研究报道人抗菌肽 LL-37、猪抗菌肽 PG-1 和羊抗菌肽 SMAP-29 均对人鼻病毒(human rhinovirus,HRV)有直接抗病毒作用20-21。防御素 HD5 可阻断人腺病毒(human adenovirus,HAdV)的脱膜和基因组暴露,使病毒侵入细胞时无法脱壳而在溶酶体中积累,从而拮抗病毒感染22。乳铁蛋白对 HAdV 的抗病毒活性可发生在感染期间的多个阶段23。3 多肽的免疫调节作用 多肽除抗病毒、杀菌作用之外,还具有免疫调节作用。3.1 抗原的识别 多肽可作为抗原,激发免疫系统产生免疫应答的分子,基于肽的疫苗已被广泛用于针对病毒的免疫反应。肽疫苗是通过与患者的人类白细胞抗原(human leucocyte antigen,HLA)结合进行表达,HLA 分子将肽疫苗呈递给 T 细胞受体,从而诱导特异性 T 细胞反应。有研究报道基于五种来源于 HCV 基因型 1 和 2 的核心、NS3 和 NS4 蛋白的保守区域设计的肽疫苗 IC41,以多聚 L-精氨酸为佐剂,在期临床试验中,对 60 名 HLA-A2 慢性无应答反应感染者接种 IC41,发现有 67%的患者产生T 细胞免疫应答反应24。3.2 调节宿主的炎症反应多肽具有促炎和抗炎作用,可通过作用于先天免疫细胞(如吞噬细胞、自然杀伤细胞、树突状细胞等),间接调节趋化因子和固有免疫分子(补体、细胞因子等)的释放,调节感染患者体内免疫反应来减少病毒感染所引发的剧烈炎症反应。细胞因子风暴是 SARS-CoV-2 重症感染者的主要死亡原因,有临床研究表明 AMY-101(一种高度选择性的补体 C3 抑制剂)可抑制 COVID-19患者体内通过补体系统(C3)激活导致的炎症反应,但仅开展了期临床试验,明确结果需通过进一步临床研究完善25-27。LL-37 通过调节固有免疫细胞,特别是嗜中性粒细胞 IL-8 的释放,减少 IAV 对机体肺部的损伤28,也可抑制巨噬细胞焦亡,诱导促炎细胞因子的释放29。3.3 调节信号通路 多肽可作为信号分子,与免疫细胞上的受体结合影响免疫应答。多肽可以与 Toll 样受体(toll-like receptors,TLRs)信号通路相互作用,影响 Toll 样受体的识别和免疫应答。有研究表明 HNP-1 能够与 HAdV-C5、HAdV-D26 和 HAdV-B35 的衣壳直接结合,并将病毒定位到 TLR4 复合59医学研究与战创伤救治2024 年1 月 第37 卷 第1 期 J Med Res Combat Trauma Care,Vol.37,No.1,January,2024物以促进 HAdV 的侵入,并诱导 NLRP3 炎症小体激活和 IL-1 释放30。LL-37 能够通过调节 IIFN 信号通路介导抗 ZIKV 的作用31。综上所述,多肽可直接作用于病毒颗粒,或者通过干预病毒生命周期的各个阶段去阻断病毒的感染,其作用机制主要分为三种:干扰病毒的吸附和进入,通过破坏病毒和靶细胞识别和结合过程导致病毒感染失败;抑制病毒复制;参与宿主抗病毒免疫调节。4 结 语 多肽药物相较于小分子药物具有更好的特异性和生物多样性,且不良反应低;同时比生物制品(蛋白质或抗体)成本低、组织渗透性好、易于改造。与传统抗生素相比,具有免疫调节活性、耐药性较低等优势。但是多肽的应用也存在以下问题。首先,天然多肽半衰期短、在体内稳定性差,易受蛋白酶的降解。但有研究指出可通过序列修饰、环化如聚乙二醇化、拟肽等方法修饰或掩盖多肽的潜在切割位点,从而减少蛋白酶的识别和蛋白降解,也可纳米载体递送方式解决其分子量较大的问题。其次,多肽如多粘素对机体肾脏和神经存在潜在毒性,以及一些抗微生物肽对真核细胞(特别是红细胞)的毒性作用等不良反应限制了其在临床上的应用。化学修饰的设计、治疗指数的引入、基于目标的合理化修饰和合成可提高未来多肽的疗效。此外,如果要使多肽得到可持续的应用,就必须掌握它们是否可规避目前传统抗病毒药物耐药性问题。总之,抗病毒多肽药物的研发由实验结果转化为临床药物,需完善设计、合成、实验、临床试验等一系列研究过程,以其巨大的抗病毒潜能、市场应用前景和经济优势仍十分具有科学价值。【参考文献】1 Wang C,Wang S,Li D,et al.Human Intestinal Defensin 5 In-hibits SARS-CoV-2 Invasion by Cloaking ACE2J.Gastroenter-ology,2020,159(3):1145-1147.2 Beddingfield BJ,Iwanaga N,Chapagain PP,et al.The Integrin Binding Peptide,ATN-161,as a Novel Therapy for SARS-CoV-2 InfectionJ.JACC Basic Transl Sci,2021,6(1):1-8.3Wang 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