黄芪甲苷调控CD45 PTPase介导抗脓毒症免疫机制的研究.pdf

第47 卷第1期2024年2 月云南中医药大学学报http:/Journal of Yunnan University of Chinese MedicineVol.47 No.12.2024黄芪甲苷调控CD45PTPase介导抗脓毒症免疫机制的研究杨海浩1,2，应赛1，顾茜兰3，邹楠婷1，吴招，张春菲1，张浩洪，万春平1*（1.云南中医药大学，云南昆明6 50 50 0；2.云南经济管理学院，云南昆明6 50 10 6；3.镇雄县中医医院，云南昭通6 57 2 0 0)摘要：目的研究黄芪甲苷（AstragalosideIV，A SI I V)抗脓毒症效应及免疫学机制，为黄芪临床应用脓毒症治疗提供科学依据。方法采用盲肠结扎穿刺术(Cecal ligation and puncture,CLP)构建脓毒症小鼠模型，随机分为假手术组、模型组、黄芪甲苷组、Anti-CD45单抗组、Anti-CD45单抗+黄芪甲苷组。H&E染色检测肺组织病理损伤；流式细胞术检测脾脏Th1细胞表达水平；实时荧光定量PCR(Real-timePCR)检测Th1细胞相关基因(IL-2、T-bet、ST A T 1和STAT4）)m RNA 的表达。结果与模型组比较，黄芪甲苷干预显著提高脓毒症模型小鼠生存率,减轻模型小鼠肺组织病理损伤。CD45抗体干预后，阻断了黄芪甲苷提高生存率和减轻肺组织病理损伤的作用。机制研究结果表明，黄芪皂苷显著增加模型小鼠Th1细胞（CD4+IFN-*）比例，上调Th1细胞相关基因（IL-2、T-b e t、STAT1、ST A T 4)m RNA 表达,CD45抗体干预后，减少了黄芪甲苷促脾淋巴细胞Th1细胞比例,阻断黄芪皂苷促Th1细胞相关基因。结论黄芪甲苷通过调控CD45分子，提高Th1细胞介导的免疫反应，介导抗脓毒症效应。关键词：脓毒症；黄芪甲苷;CD45蛋白酪氨酸磷酸酶；Th1细胞；盲肠结扎穿孔术中图分类号：R285.5D0I:10.19288/ki.issn.1000-2723.2024.01.011Anti-Sepsis Immunological Mechanism of Astragaloside IVYANG Haihaol-2,YING Sai,GU Qianlan,ZOU Nanting,WU Zhao,ZHANG Chunfeil,ZHANG Haohong,WAN Chunping(1.Yunnan University of Chinese Medicine,Kunming 650500,China;2.Yunnan College of Business Management,Kunming 650106,China;3.Zhengxiong Country Hospital of traditional medicine,Zhaotong 657200,China)ABSTRACT:Objective The aim of this study was designed to investigate the effect of Astragaloside IV on sepsis andits immunological mechanism.This study will provide a basis for the theoretical foundation of anti-sepsis immunotherapy ofAstragalus.Methods CLP(Cecal ligation and puncture)model was established to investigated the anti-septic potential andreveal its underlying mechanisms,the mice with CLP were divide into five groups including sham group,model group,Astragaloside IV group,Anti-CD45 Ab group and Astragaloside II+Anti-CD45 Ab group.Lung injury in sepsis mice wasassessed by H&E staining.The percentage of Th1 cells(CD4*IFN-)were detected by flow cytometry.The mRNA expressionof Thl cytokine and transcript factor T-bet were examined by q-PCR analysis.Results Compared with model group,treatmentof Astragaloside IV can markedly improve the survival rate and reduce inflammatory lung injury in sepsis mice.However,anti-CD45 Ab treatment intensely blocked anti-septic effect including the enhanced survival rate and lung injure,whichinduced by Astragaloside IV.Furthermore,expression of Th1 cells(CD4+IFN-t)and Th1 cells related gene(IL-2,T-bet.STAT1,STAT4)mRNA expression were markedly increased in Astragaloside IV group comparison with model group.Whereas,the percentage of Th1 cells and Thl cells related gene were significantly decreased in Astragaloside IV+Anti-CD45 Abgroup.Conclusion Astragaloside IV might promote Thl cell-mediated immune response in sepsis through CD45 proteintyrosine phosphatase activity.This mechanism will provide a basis for the clinical application of Astragalus in treating sepsis.KEY WORDS:sepsis;Astragaloside IV;CD45 protein tyrosine phosphatase;TI help cells;cecal ligation and puncture基金项目：国家自然科学基金项目（8 19 6 0 7 45）作者简介：杨海浩（19 9 5-），男，硕士研究生，E-mail：y h h 18 7 8 6 3 16 3.c o m*通信作者：万春平（19 8 1-）,男，副研究员，博士生导师,研究方向：中医药治疗炎症免疫相关疾病的基础研究及临床评价，E-mail:57文献标志码：Athrough Activating CD45 PTPase文章编号：10 0 0-2 7 2 3(2 0 2 4)0 1-0 0 57-0 52024年脓毒症(sepsis)是由感染因素引起的全身炎症反应综合征，进而诱发脓毒性休克、多器官功能障碍综合征，是急诊及重症加强治疗病房(ICU)患者主要死亡原因之一，目前尚缺乏有效的治疗措施！。研究已证实，后期免疫抑制及继发感染是脓毒症患者的主要死亡原因。脓毒症免疫抑制的机制包括：Th1/Th2平衡的改变、不同免疫细胞功亚群能失常、T细胞调亡增加等 2 。因此,如何通过药物干预逆转脓毒症患者免疫失能状态，已成为脓毒症治疗的重要手段。黄芪为治一切“气衰血虚”之症常用补益中药，具有健脾补中、升阳举陷、益卫固表、利尿、托毒生肌之功效。研究表明，黄芪皂苷为黄芪主要活性成分，具有广泛的生物活性，药理作用主要集中在免疫调节、抗肿瘤、抗感染和抗炎等方面 3。而这些药理作用对于改善脓毒症机体免疫抑制状态及清除病原体具有重要的治疗意义。最新研究已报道，黄芪甲苷具有显著抗脓毒症的效应，但确切的免疫学机制尚未明确。课题组前期通过CD45高通量小分子调节剂筛选模型，首次发现黄芪皂苷能够显著激活CD45蛋白酪氨酸磷酸酯酶(PTPase)酶活性,从而促进Th1 细胞免疫反应，介导抗肿瘤免疫反应 4-7。最新研究已证实,CD45分子在T细胞抗原受体信号通路中发挥关键调控作用，而T淋巴细胞与脓毒症的发生与转归密切相关。基于此,提出“黄芪甲苷激活CD45PTPase影响T淋巴细胞免疫反应介导抗脓毒症作用”为科学假设，本研究通过构建盲肠结扎穿孔术后脓毒血症模型，研究黄芪甲苷抗脓毒症的效应及免疫学机制，为黄芪临床应用脓毒症治疗提供科学依据。1材料和方法1.1实验动物C57BL/6小鼠,购自斯贝福（北京）生物技术有限公司提供，7 8 周龄，体质量2 0 2 2 g，雄性，合格证号：SCXK（京）2 0 19-0 0 10。动物饲养在SPF级动物房，实验动物至少适应性饲养1周后使用。饲养条件：温度（2 2 1），湿度55%5%。饲料和水均经过消毒，并由动物自由摄取。全部动物实验均严格按照实验动物有关条例实施。实验方案通过云南中医药大学第一附属医院医学伦理委员会审查(DW2023-003)。1.2药物与试剂黄芪甲苷（批号：110 7 8 3-2 0 17 13）购自美仑生物；生理盐水（批号：H53020469)购自昆明南疆制药有限公司；碘酒（批号：2 0 16 0 90 8）购自江西58云南中医药大学学报草珊瑚消毒用品有限公司；16 40 培养基（批号：412600-300)购自北京Solarbio公司；青霉素（批号：H3702081)购自山东鲁抗医药股份有限公司；总RNA提取试剂盒（批号：Q5704)购自天根生化科技有限公司；逆转录试剂盒（批号：AK5002)购自宝生物工程（大连）有限公司;SYBRPremixExTaqI（批号：AK4005）购自TaKaRa;Anti-Mouse IFN-（批号:B307613)均购自美国Biolegend公司;Anti-MouseCD45（批号：1960973)购自invitrogen公司。2实验方法及评价2.1盲肠结扎穿孔术小鼠模型的构建C57BL/6小鼠适应性饲养5d后，术前禁食不禁水。脓毒症造模方法采用国际公认的盲肠结扎穿孔术，具体方法如下：每只小鼠腹腔注射4%的水合氯醛麻醉，注射体积为10mL/kg麻醉。麻醉后背位固定小鼠，备皮处理,沿腹中线做1cm切口,开腹分离肠系膜及盲肠,在盲肠近端1/3处用4号线结扎，2 1G号针在结扎部位中部处贯通穿刺，在穿孔处挤出少量粪便，随后将盲肠回纳人腹腔,逐层缝合关腹。术后立即皮下注射37 生理盐水5mL/100g（补充术中液体丢失）和0.0 5mg/kg丁基原啡因（每6 h一次，持续2 d),同时每只小鼠肌注青霉素2*10 4U以预防切口感染。假手术组找出盲肠后不穿刺迅速将盲肠回纳入腹腔,其余同上述操作。2.2分组和给药术后2 h,将50 只小鼠随机分为5组：假手术组、模型组、Anti-CD45单抗组、黄芪甲苷组、Anti-CD45单抗+黄芪甲苷组。假手术组和脓毒症模型组腹腔注射等体积生理盐水;Anti-CD45单抗组腹腔注射Anti-CD45单抗(1mg/kg);黄芪甲苷组灌胃黄芪甲苷10 mg/kg;Anti-CD45单抗+ASI-IV黄芪甲苷组：腹腔注射Anti-CD45单抗(1mg/kg)+灌胃黄芪甲苷10 mg/kg，分组完成后，按照上述剂量给药，连续给药7 d。将小鼠饲养于实验室SPF级动物实验室，随时观测其状态和体征，观察脓毒症术后实验小鼠生存状态。2.3H&E染色检测肺组织病理损伤取约0.5cm0.3cm1cm大小的右肺叶上叶组织，浸于4%多聚甲醛中12 h，捞出固定好的组织经PBS冲洗，梯度乙醇进行组织脱水，液态石蜡包埋，行4m切片，载玻片捞片后烘烤2 h。随后二甲苯、乙醇处理脱蜡，苏木素浸染，1%盐酸乙醇分化，伊红浸染，再次进行梯度乙醇脱水，二甲苯透明,最后采用中性树胶封片，显第47 卷第1期微镜下观察肺组织病理学变化。2.4流式细胞术检测脾脏Th1 细胞表达水平无菌取其脾脏,载玻片轻轻研磨脾脏,滤膜过滤，离心（41200rpm离心5min），弃上清，使用红细胞裂解液裂解红细胞，加人2%FBS-1640终止裂解，PBS洗2次后，加入10%FBS1640培养基，将细胞调至510 5个。对胞内细胞因子染色：各组110 6 个小鼠脾淋巴细胞与PMA、l o n o m y c i n 和BFA置于37 5%CO2培养箱中培养4h后，收集细胞，洗液洗2 次，加入IgG抗体,封闭FcR,进行表面标志染色。完毕后,固定、穿膜,加人荧光标记的抗IFN-和IL-17A抗体，流式细胞仪检测,Flowjo软件分析。2.5实时荧光定量PCR(Real-time PCR)检测mR-NA的表达常规制备各组小鼠脾淋巴细胞,调细胞浓度为110 7 个，离心，弃上清，加入Trizol裂解液1mL，裂解脾淋巴细胞。参照总RNA提取试剂盒说明书，提取总RNA。采用超微量核酸蛋白检测仪RNA定量，反转成cDNA。以转录所得的cDNA为模版,取同一份cDNA作为扩增模板，按照SYBRPremixExTaq染料使用说明书,Real-timePCR检测Th1细胞相关基因（IL-2、T-b e t、ST A T 1 和 STAT4)的表达,结果以Ct值显示。目的基因表达的相对差异量用2-A法进行统计分析,详细的PCR引物序列如下表：引物名称IL-2(Forward):5-TGAGCAGGATGGAGAATTACAGG-3(Reverse):5-GTCCAAGTTCATCTTCTAGGCAC-3STAT1(Forward):5-CAAGTGTTATGGGACCGCAC-3(Reverse):5-CTCTCATTCACATCTCTCAACTTCA-3STAT4(Forward):5-AGCCATCTCGGAGGAATA-3(Reverse):5-CAGACAACCGGCCTTTAT-3T-bet(Forward):5-GATCACTCAGCTGAAAATCGAC-3(Reverse):5-GATCACTCAGCTGAAAATCGAC-3b-actin(Forward):5-GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3(Reverse):5-CCAGTTGGTAACAATGCCATGT-3Sham杨海浩等：黄芪甲苷调控CD45PTPase介导抗脓毒症免疫机制的研究6Time/Day引物序列图1各组小鼠7 d生存率比较3.2黄芪甲苷调控CD45PTPase介导改善脓毒症模型小鼠肺组病理损伤程度，如图2 所示：假手术组小鼠肺组织结构正常，细胞间隔少量渗出，肺泡结构规则完整；脓毒症模型组小鼠较假手术炎症细胞浸润严重,毛细血管扩张出血，炎症加重。与脓毒症病理模型组比较，黄芪甲苷组干预后，显著减轻小鼠肺组织病理损伤，而Anti-CD45+黄芪甲苷组小鼠肺组织病理损伤无明显改善，提示黄芪甲苷调控CD45PTPase介导改善脓毒症模型小鼠肺组织病理损伤。ModelAnti-CD452.6统计学处理所有实验数据以(xs)表示,组间差异行单因素方差(One-WayANOVA)分析;方差不齐，采用LSD法分析,P8Anti-CD45+ASIIV图2 各组小鼠肺组织形态（HEx200）592024年3.3黄芪甲苷调控CD45PTPase介导提高脓毒症Th1 细胞免疫反应Th1细胞主要参与细胞免疫,在抗病原体感染方面发挥关键作用。我们进一步采用荧光定量PCR检测脓毒症模型小鼠脾脏Th1细胞相关基因表达。结果如图3所示，与假手术组比较，脓毒症病理模型组脾淋巴细胞Th1细胞相关基因IL-2、T-bet、ST A T 1和STAT4mRNA显著下降，差异具有显Vehicle.OK云南中医药大学学报著性意义（P0.01）。黄芪甲苷干预后,IL-2、T-b e t、STAT1、ST A T 4的mRNA均显著上调，且差异均具有显著性意义（P0.05、或P0.01）,而给予Anti-CD45单抗干预后,取消了Th1细胞相关基因mRNA表达，提示黄芪甲苷可能通过激活CD45PTPase，提高Th1细胞的介导的免疫反应。Anti-CD45ASIIV1.0K-1.0K第47 卷ASI IV+Anti-CD45OK800-600-400-200-10IFN-Y注：-P0.01,Sham组与Vehicle比较；P0.05，Ve h i c l e 组与ASIIV组比较；*P0.01,Vehicle组与ASIIV组比较；+P0.05，ASIIV组与Anti-CD45+ASI IV组比较；P0.01,ASI IV组与Anti-CD45+ASIIV组比较。3.4黄芪甲苷调控CD45PTPase介导提高脓毒症Th1细胞(IFN-)表达水平流式细胞术检测结果显示，与脓毒症病理模型组比较，黄芪甲苷药物干预显著上调CLP模型小鼠脾淋巴细胞Th1细胞（CD4+IL-22.01*1.51.00.5-0.0-ShamVehicleAnti-CD454讨论研究已证实，在脓毒症病理机制中，免疫功能紊乱是脓毒症主要病理生理机制之一，尤其后期免疫抑制及继发感染是脓毒症患者的主要死亡原因。机体的免疫反应中，T淋巴细胞发挥着重要作用，T淋巴细60800-000-4000.720.7210103800-800-4001.102001.10103104gated in CD4图3各组小鼠脾淋巴细胞IL-2、T-b e t、ST A T 1、ST A T 4m R NA 水平比较+2.512.01.51.00.50.0ASIV Anti-CD45ShamVehicleAnti-+ASIVCD45图4各组小鼠脾淋巴细胞Th1细胞(CD4+IFN-+）表达水平比较800-000-4001.39200-2001.381051000.880.8810102T-betASIVAnti-CD45+ASIV1010105100IFN-*)表达，而与黄芪甲苷治疗组比较，黄芪甲苷+Anti-CD45抗体组脾淋巴细胞Th1细胞表达下降,结果见图4。提示Anti-CD45单抗干预后，取消了黄芪甲苷促脾淋巴细胞Th1细胞效应。STAT12.5*2.01.51.00.50.0ShamVehicleAnti-CD45胞不仅是细胞免疫功能的承担者，而且也是免疫应答的调节者,其功能状态与脓毒症的发生和转归2 密切相关。CD45分子广泛表达在淋巴细胞表面跨膜蛋白酪氨酸磷酸酯酶(PTPase),在酪氨酸磷酸化过程中发挥重要作用。研究表明，CD45分子在T细胞抗原受1o102103ASIVAnt-CD45+ASIN104105102.512.01.51.00.5-0.0ShamVehicleAnti-ASIVAnt-CD45+CD45ASIV10102STAT410310105第1期体信号通路中发挥关键调控作用，而T淋巴细胞与脓毒症的发生与转归密切相关 8-10 。课题组前期在CD45高通量小分子调节剂筛选模型和细胞模型，发现黄芪甲苷能够激活CD45PT-Pase,诱导Thl细胞介导免疫反应,增强抗肿瘤免疫反应和抗复发转移。研究已证实，黄芪皂苷对脓毒症具有显著的疗效，然而其抗脓毒症的免疫学机制尚未明确叫。由于后期免疫抑制及继发感染是脓毒症患者的主要死亡原因，而课题组前期发现黄芪皂苷激活CD45PTPase介导免疫增强作用新机制。基于此，在脓毒症免疫抑制状态病理环境下，我们提出“黄芪皂苷调控CD45PTPase影响T淋巴细胞免疫反应介导抗脓毒症作用”的科学假设。因此，本研究为进一步验证这种推测，我们进一步使用CD45抗体作为工具，进一步研究黄芪甲苷抗脓毒症的免疫学机制。本研究结果显示，黄芪甲苷能够显著提高脓毒症小鼠生存率，减轻脓毒症模型小鼠肺组织病理损伤,且该作用能够被Anti-CD45单抗所取消，进一步提示黄芪甲苷可能通过调控CD45分子介导抗脓毒症效应。适应性免疫参与脓毒症炎症反应抗原提呈细胞（A PC)在提呈抗原的同时,可分泌细胞因子诱导初始T细胞分化为CD4+细胞亚群，包括Th1、T h 2、T h 17及Treg的产生和分化 12-14。Th1 细胞主要分泌IFN-,IL-2等细胞因子,主要介导细胞免疫、细胞毒性T细胞、巨噬细胞活化等功能。T-bet作为 Th1 细胞分化调控的关键转录因子，能够促进Th1特征性基因IFN-和IL-2 的表达。STAT1,STAT4作为 Th1细胞关键蛋白，在Th1细胞分化中起着重要作用。研究表明，Th1细胞优势反应利于机体清除感染原，其中IFN-是体内重要的细胞因子,机体初始和过继免疫系统抵抗各种细菌和病毒感染中发挥着重要的作用，因此IFN-是判断是否存在脓毒症免疫抑制的重要指标之一 15-18 。重组 IFN-作为脓毒症治疗的免疫疗法，已取得显著疗效。研究显示，重组IFN-能够逆转脓毒症单核细胞功能，清除病源微生物，提高脓毒症患者的生存率 8 。研究结果显示,黄芪甲苷提高脓毒症模型小鼠脾淋巴细胞Th1细胞(CD4+IFN-)表达，显著上调IL-2、T-b e t、ST A T 1 和 STAT4的mR-NA,Anti-CD45单抗干预后,取消了黄芪甲苷促脾淋杨海浩等：黄芪甲苷调控CD45PTPase介导抗脓毒症免疫机制的研究从而产生对脓毒症的治疗作用。参考文献：IARORA J,MENDELSONAA,FOX-ROBICHAUD A.Sepsis:network pathophysiology and implications for earlydiagnosisJ.Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol,2023,324(5):R613-R624.2 WIERSINGAW J,VAN DER POLL T.Immunopathophys-iology of human sepsisJ.EBioMedicine,2022,86:104363.3 QI Y,GAOF,HOU L,et al.Anti-Inflammatory and im-munostimulatory activities of astragalosidesJ.Am J ChinMed,2017,45(6):1157-1167.4王敏，郑喜，普晓佳，等.黄芪皂苷II调控CD45PTPase诱导抗肿瘤免疫效应的研究 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