猪源SLPI对小鼠皮肤损伤愈合的效果.pdf
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1、北京农学院学报2 0 2 4,39(1):47-51Journal of Beijing University of Agriculturehttp:/doi:10.13473/ki.issn.1002-3186.2024.0110猪源SLPI对小鼠皮肤损伤愈合的效果肖瑞龙,郭津彤,李新新,刘雪威,李焕荣*(北京农学院动物科学技术学院/动物类国家级实验教学示范中心/生物芯片北京国家工程研究中心畜禽健康养殖分中心,北京10 2 2 0 6)摘要:【目的】探究猪源分泌性白细胞蛋白酶抑制因子(SecretoryLeukocyteProtease Inhibitor,SLPI)对皮肤创伤愈合过程中的治
2、疗效果,以开发其潜在的使用价值。【方法】使用重组表达的猪源SLPI处理小鼠创伤,筛选蛋白的最佳作用浓度,再以此浓度探索其抗损伤愈合情况。设置创伤组、SLPI处理组及阳性药对照组(阳性药物为百灵金方抑菌液),观察不同时间大体病理变化与显微病理变化,对创伤愈合进行临床评分,来评判SLPI对伤口恢复的影响作用。【结果】结果显示,SLPI最佳作用浓度为0.2 5mg/mL。三组小鼠创伤溃疡面随时间延长均逐渐减小;与创伤组相比,从第3天开始,SLPI处理组病理打分均低于创伤组(P0.05或P0.01),而与阳性药组表现接近(P0.05);在第7 天,阳性药组和SLPI组均可观察到毛囊生长,但创伤组变化不
3、明显。显微病理变化显示,SLPI组和阳性药组在第5天可观察到表皮层和皮脂腺,在第7 天成纤维细胞数量明显较多,炎性细胞浸润减少。【结论】重组表达的猪源SLPI对小鼠皮肤创伤愈合有一定效果,为开发针对猪体皮肤损伤有效药物提供了试验数据。关键词:猪源;分泌性白细胞蛋白酶;抑制因子;皮肤创面愈合;小鼠中图分类号:S854.5+3文章编号:10 0 2-318 6(2 0 2 4)0 1-0 0 47-0 5文献标志码:AExploration of the effect of porcine secretory leukocyte proteaseinhibitor on skin injury h
4、ealing in miceXIAO Ruilong,GUO Jintong,LI Xinxin,LIU Xuewei,LI Huanrong(College of Animal Science and Technology,Beijing University of Agriculture;National Experimental TeachingDemonstration Center for Anima;Branch Center for Animal Health Breeding Research,National EngineeringResearch Center for Be
5、ijing Biochip,Beijing 102206,China)Abstract:ObjectiveJTo investigate the therapeutic effect of porcine secreted leukocyte protease inhibitor(SLPI)on skin woundhealing and explore its potential value.MethodsJThis study used recombinant pig derived SLPI to treat mouse wounds,screened the optimal conce
6、ntration of the protein,and then explored its anti injury healing effect at this concentration;The ex-periment was divided into trauma group,SLPI treatment group,and positive drug control group(Positive drug represents Bail-ingjinfangyijunye).The gross pathological changes of mouse wounds at differe
7、nt times and microscopic pathological changeswere observed,and the clinical score of wound healing were used to evaluate the effect of SLPI on wound recovery.ResultsThe results showed that the optimal concentration of SLPI was O.25 mg/mL.The ulcerated area of the wound gradually de-creased over time
8、 in all three groups of mice.Compared with the trauma group,from day 3 onwards,the pathological scores ofthe SLPI treatment group were lower than those of the trauma group(P0.05 or P0.01),and the performance was similarto that of the positive drug group.At day 7,both the positive drug control group
9、and SLPI group showed hair follicle growth,while changes in the injury group were not significant,Microscopic pathological changes showed that compared to the blankcontrol group,the SLPI group and positive drug control group displayed epidermal layers and sebaceous glands on day 5,and onday 7,a sign
10、ificantly higher number of fibroblasts and reduced inflammatory cell infiltration were observed.ConclusionJIn收稿日期:2 0 2 3-10-19基金项目:北京市教委与北京自然基金联合科技重点项目(KZ201910020021)第一作者:肖瑞龙,硕士研究生,研究方向为预防兽医学,E-mail:x i a o r u i l o n g 12 0 7 16 3.c o m通信作者:李焕荣,女,教授,研究方向为猪病毒性疾病,E-mail:l i h u a n r o n g l 12 6.
11、c o m48summary,the recombinant expression of pig derived SLPI has a certain effect on mouse skin wound healing,providing experi-mental data for the development of effective drugs targeting pig skin injury.Keywords:porcine;secretory leukocyte protease;inhibitor;skin injury healing;mice分泌性白细胞蛋白酶抑制剂(Se
12、cretory Leuko-cyte Protease Inhibitor,SLPI)是一个可抑制多种丝氨酸蛋白酶活性的阳离子蛋白质,是由粘膜上皮细胞分泌的非糖基化单链多糖蛋白,具有抗病毒、抗细菌、抗炎症因子及诱导细胞增殖分化等生物学功能,对创伤组织的愈合也有促进作用11。屈纪富等2 对于SLPI在创伤愈合中的潜在应用前景报道中称SLPI的生物学功能与皮肤创口愈合关系密切,通过伤口给药可以抑制皮肤组织NF-kB的活化导致促炎细胞因子IL-6和IL-1 的产生减少,加速伤口愈合过程2.3。此外,SLPI也有促进细胞增殖的作用4,可以通过促进真皮多能干细胞增殖,促进肉芽组织形成,达到促进创面修复的
13、功能5-8 。养猪业是中国畜牧养殖的支柱产业之一,猪肉的市场需求在不断地增加。皮肤创伤是猪生长过程中最常见的现象,及时正确的处理,不会影响其生长;若处理不当,轻则影响猪的生产性能,重则会危及生命9。然而,目前猪SLPI对皮肤损伤方面的研究还相对较少。该研究拟对猪源SLPI能否促进皮肤创面愈合进行试验研究,为进一步系统深入地研究SLPI促进创伤愈合的机制和新一代创伤修复特效药研制方面奠定试验基础。1材料和方法1.1订试验动物和试剂试验所用的动物是体质量2 8 32 g、2 月龄的SPF级KM(Kunming)小鼠,适应性饲养3d,自由饮水、采食。pET-28a-2SLPI质粒由北京农学院动物科学
14、技术学院微生物实验室保存,His标签蛋白纯化试剂盒(包涵体蛋白)购于江苏康为世纪生物科技股份有限公司,PAGE凝胶快速制备试剂盒(12.5%)购于上海雅酶生物科技有限公司,IPTG溶液和BCA蛋白测定试剂盒购于北京索莱宝科技有限公司,SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5X)、W e s te r n Blo t试剂盒和预染蛋白Marker(1018 0 k D a)购于北京兰博利德生物技术有限公司,百灵金方抑菌液(阳性药物)购于河南灵创药业有限公司,乙醚购于天津市大茂化学试剂厂。1.2方法1.2.1His-SLPI的制备与纯度分析利用实验室北京农学院学报已有的pET-28a-SLPI甘油菌进行扩
15、增后提取SLPI蛋白,按照康为世纪His标签蛋白纯化试剂盒(包涵体蛋白)说明书操作,进行重组His-SLPI蛋白的纯化工作。将装有His-SLPI蛋白的透析袋依次置于8.0 mol/L、6.0 m o l/L、4.0 m o l/L、2.0mol/L尿素溶液中进行蛋白质复性,BCA法测定His-SLPI的浓度;Western blotting对其纯度进行分析,其中一抗为鼠抗His标签,二抗是HRP标记的山羊抗小鼠IgG。1.2.2小鼠皮肤损伤模型构建根据Cross等的造模方法10 ,小鼠经乙醚吸入麻醉后,背部脱毛,形成约2.0 cm的裸露皮肤,备用。用尖锐利器在已除毛的小鼠背正中线上进行创伤处
16、理,形成大小、深度均一的创伤,用干燥纱布擦净因创伤而渗出的血液,造模结束,用于后续试验。小鼠造模后单笼饲养,并将造模当天记为第0 天。1.2.3His-SLPI最适作用浓度的筛选用PBS倍比稀释纯化浓缩蛋白SLPI,设置5个浓度梯度,分别为2.0 mg/mL、1.0 m g/m L、0.5 m g/m L、0.25mg/mL、0.12 5m g/m L。选取18 只体重形态相近的损伤模型小鼠,将其随机分为6 组,每组3只,其中5组分别以不同浓度SLPI分别进行涂抹,另一组不做任何处理作为创伤组用于对照。观察记录从第1天到伤口基本愈合中伤口恢复情况,对伤口进行病理评估,筛选His-SLPI最适的
17、作用浓度。1.2.4His-SLPI作用效果评定共设3组,每组随机抓取6 只损伤模型小鼠,分别为创伤组、阳性对照组、SLPI处理组。创伤组不予任何处理,阳性药对照组使用百灵金方抑菌液处理,SLPI组使用最适作用浓度His-SLPI蛋白处理。分别在第1天、第 3天、第7 天对所有小鼠进行观察并拍照记录,观察创口愈合情况。临床评分按照Martins的方法6 ,有4个临床指标,分别是充血红肿、疱疹和/或脓疱、出血和/或渗出、痴皮。将上述临床症状作为评判标准,同时依据严重程度来进行评分,没有明显症状或无出血/渗出的记为0 分,轻度症状或少量出血/渗出记为1分,中等症状或中量出血/渗出的记为2分,严重症
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