咯利普兰对猪中性粒细胞表达Mac-1的作用及有关信号机制.pdf

北京农学院学报2 0 2 4，39（1）：52-57Journal of Beijing University of Agriculturehttp:/doi:10.13473/ki.issn.1002-3186.2024.0111咯利普兰对猪中性粒细胞表达 Mac-1 的作用及有关信号机制张旭日，张溪园，王恩慈，郭雨楠，李姣，黄安琦，姜代勋*（北京农学院动物科学技术学院/兽医学（中医药）北京市重点实验室，北京10 2 2 0 6）摘要：【目的】阐明咯利普兰为代表的磷酸二酯酶4抑制剂的抗炎新机制。【方法】采用密度梯度离心法分离猪中性粒细胞，流式细胞术检测猪中性粒细胞表达巨噬细胞表面分子抗原-1（Macrophage surface molecular anti-gen-1，M a c-1)；Re a l-t i m e q PCR和Westernblot技术检测猪中性粒细胞p38丝裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）、细胞外调节蛋白激酶（ERK）、p 6 5核转录因子（p65NF-kB）m RNA 表达和磷酸化活性。【结果】佛波酯（phorbol myristate acetate，PM A）可显著上调中性粒细胞表达Mac-1（P 0.0 1），咯利普兰对PMA上调的中性粒细胞表达Mac-1有一定抑制作用，其中，5mol/L咯利普兰可极显著抑制中性粒细胞表达Mac-1(P0.01)；PM A 可极显著上调中性粒细胞p38MAPK、ERK 和p65NF-cBmRNA表达和磷酸化活性（P 0.0 1)，5u m o l/L咯利普兰对PMA升高的中性粒细胞p38MAPK、p 6 5NF-k Bm RNA 表达有极显著抑制作用（P0.01），对ERKmRNA表达有显著抑制作用（P0.05），对PMA升高的中性粒细胞p38MAPK、ERK和p65NF-cB磷酸化活性有极显著抑制作用（P0.01)。【结论】咯利普兰可显著抑制中性粒细胞表达Mac-1，其机制与阻遏p38MAPK、ERK、p 6 5NF-k B基因表达和磷酸化活性有关。关键词：巨噬细胞表面分子抗原-1；p38丝裂原活化蛋白激酶；细胞外调节蛋白激酶；p65核转录因子；咯利普兰；中性粒细胞；猪中图分类号：S859.1文章编号：10 0 2-318 6（2 0 2 4）0 1-0 0 52-0 6 文献标志码：AEffect of Rolipram on expression of Mac-1 in porcineneutrophils and its signaling mechanismZHANGXuri,ZHANG Xiyuan,WANG Enci,GUO Yunan,LI Jiao,HUANG Anqi,JIANG Daixun*(Beijing Key Laboratory of Traditional Chinese Veterinary Medicine,College of Animal Science andTechnology,Beijing University of Agriculture,Beijing 102206,China)Abstract:Objective The inhibitory effect of rolipram on neutrophil adhesion is associated with the expression of Macrophagesurface molecular antigen-1(Mac-1).In this study,we investigated the role of rolipram in regulating Mac-1 and uncovered anovel anti-inflammatory mechanism of phosphodiesterase 4 inhibitors using phorbol myristate acetate(PMA).MethodsJPor-cine peripheral blood neutrophils were isolated and purified using density gradient centrifugation.The expression of Mac-l onneutrophils was determined using Flow Cytometry.The gene expression and phosphorylation activity of signaling proteins,in-cluding p38 MAPK,ERK and p65 NF-kB,were detected by Real-Time fluorescence quantitative PCR and Western Blot,re-spectively.ResultsPMA significantly increased the expression of Mac-1 on neutrophils(Po.01).However,rolipram wasable to inhibit the PMA-induced expression of Mac-1 on neutrophils.Specifically,at a concentration of 5 mol/L,rolipram sig-nificantly inhibited the expression of Mac-1(Po.o1).Furthermore,PMA greatly increased the gene expression and phos-phorylation activity of p38 MAPK,ERK,and p65 NF-kB in neutrophils(P0.01).In contrast,rolipram at 5 mol/L effec-tively suppressed the PMA-induced gene expression of p38 MAPK and p65 NF-kB in neutrophils(P0.01).It also inhibitedthe PMA-induced gene expression of ERK(P0.05).Additionally,rolipram significantly inhibited the PMA-induced phos-收稿日期：2 0 2 3-12-2 3基金项目：北京市基金-市教委联合项目（KZ202010020030）第一作者：张旭日（19 9 7 一），女，内蒙古通辽人，硕士研究生，研究方向：中药抗炎机理，E-mail：17 42 6 6 通信作者：姜代勋，副教授，研究方向：中药抗炎机理，E-mail：d x _ t c v m 12 6.c o m2024年第1期张旭日等：咯利普兰对猪中性粒细胞表达Mac-1的作用及有关信号机制phorylation activity of p38 MAPK,ERK,and p65 NF-kB in neutrophils(P0.01).ConclusionJRolipram has been found toeffectively suppress the expression of Mac-1 on neutrophils.This inhibitory effect is attributed to its ability to inhibit gene ex-pression and phosphorylation activity of p38 MAPK,ERK,and p65 NF-sB.Keywords:macrophage surface molecular antigen-l;p38 MAPK;ERK;p65 NF-B;rolipram;neutrophils;pig咯利普兰（Rolipram）是磷酸二酯酶4（Phos-phodiesterase 4,PDE4)的经典抑制剂，通过抑制炎症细胞PDE4活性，升高cAMP水平，起到抗炎作用1-3。研究发现，咯利普兰通过降低促炎因子TNF-、IL-6 等水平L4-6、抑制巨噬细胞弹性蛋白酶和PDE4活性7-8 、抑制中性粒细胞的浸润9 等起到抗炎作用。巨噬细胞表面分子抗原1（Macrophagesurface molecular antigen-l,Mac-1）属于整合素家族黏附分子，在中性粒细胞穿过血管、浸润到组织中起关键作用10-11。前期研究表明，咯利普兰可抑制中性粒细胞和内皮细胞的黏附,其机制与抑制淋巴细胞功能相关抗原-1和Mac-1表达有关12 ，其中，激活因子甲酰三肽（Methyltripeptide，f M LP)对猪中性粒细胞表达Mac-1的上调作用并不明显，未能充分显示咯利普兰对Mac-1的抑制作用。该试验在此基础上，通过将激活因子调整为佛波酯(PMA)进一步研究咯利普兰对猪中性粒细胞Mac-1的作用以及有关的p38MAPK、ERK 和p65NF-kB调控蛋白mRNA表达和磷酸化活性，明确咯利普兰抗炎的有关分子机制，为进一步研究PDE4选择性抑制剂提供理论依据。1材料与方法1.1材料主要仪器：BDFACSCalibur型流式细胞仪（美国BD公司）、LightCycler96型实时荧光定量PCR仪（Roche公司）、ALS1296型PCR热循环仪（Bio-Rad公司）、PowerPacTM通用电泳仪电源（Bio-Rad公司）、NW型纯水仪（Heal Force集团）、DL-CJ-1ND型超净工作台（北京东联哈尔仪器制造有限公司）、HF90型CO2培养箱（HealForce集团）、3K15型低温离心机（美国Sigma）、LXJ-I I B型常温离心机（上海安亭科学仪器厂）。主要试剂:FITC Anti-CD11b antibody 2F4/11J(ab34444),Goat Anti-Rabbit IgG H&L(HRP)(ab205718)、A n t i-p 38（p h o s p h o T 18 0 +Y18 2)a n t i-body（a b 2 5412 2）、A n t i-Er k l（p T 2 0 2/p Y2 0 4）+Erk2(pT185/pY187)antibody(ab128159)购自Ab-cam公司；Phospho-NF-kBp65（Se r 536）（93H 1）Rabbit mAb#3033（30 33）购自Cell Signaling53Technology公司;Rabbit Anti-beta-Actin(LoadingControl)antibody（b s-0 0 6 1R）购于北京博奥森生物技术有限公司；PMA（H Y-18 7 39）购自MedChe-mExpress公司；Rolipram（R6 52 0）购自Sigma公司；PowerUpTM SYBRTM Green Master Mix(A25742)购于Applied Biosystems公司;TRIzolReagent（15596 0 2 6）购自Invitrogen公司；SDS-PAGE凝胶制备试剂盒（P1200）购于北京索莱宝科技有限公司。1.2中性粒细胞提取新鲜猪全血肝素抗凝，与葡聚糖混匀静置沉降红细胞，吸取微红上清液轻铺在淋巴细胞分离液上，离心去除单核细胞及淋巴细胞，加人特殊分离液保护中性粒细胞，加人超纯水继续溶胀剩余的红细胞等步骤获得中性粒细胞。将提纯的中性粒细胞稀释至2 10 8 个/mL，即可用于后续试验。有关中性粒细胞提取详见文献13。1.2.1Mac-1检测对照组（Control,无PMA）、模型组（Model,PMA 30 nmol/L)、Ro l i p r a m 组（1mol/L、5mol/L),每组3个重复。在2 4孔细胞培养板中，各组加人中性粒细胞（反应液细胞数为2 X107个/mL）,Ro li p r a m 组加人2 个浓度Roli-pram,5%COz培养箱37 平衡10 min。模型组和Rolipram组分别加人终浓度30 nmol/LPMA，对照组加人等量PBS，总反应体系为50 0 L。将2 4孔细胞培养板置于5%CO2培养箱37 培养30min。每孔吸取2 0 0 L细胞悬液，42 50 0 r/min离心10 min,PBS漂洗2 次。各管分别加入10 LMac-1抗体，室温避光孵育30 min，42 50 0 r/min离心10 min,PBS漂洗1次，获得50 0 L细胞悬液，30 0 _ m细胞筛过滤，流式细胞仪（BDBio-sci-ences)检测2 0 0 0 0 个细胞Mac-1的表达情况。1.2.2p38MAPK等基因表达检测对照组(Control,无 PMA）、模型组(Model,PMA 30 nmol/L)、Ro lip r a m 组（5 mol/L),每组3个重复。在2 4孔细胞培养板中，各组加人中性粒细胞（反应液细胞数为2 X107个/mL）,Ro li p r a m 组加人终浓度5mol/LRolipram,置于5%CO,培养箱37 平衡10min。模型组和Rolipram组分别加人终浓度30nmol/LPMA，对照组加人等量PBS，各组总体积为*54500L。将细胞培养2 4孔板置于5%CO2培养箱37培养1 h。收集细胞悬液,以Trizol法提取总RNA,进行定量后常规反转录。cDNA稀释10 倍后作为模板，以2 0 LReal-timeqPCR反应体系进行。基因引物通过查阅文献和GeneBank，由生工基因正向引物ForwardPrimer(523)p38MAPK14GGAGGACAGGAAGAGGAAGAAAERKGACCCAACAGATGAGCCAGTp65 NF-kBCTCAAGATCTGCCGGGTGAA-actinCCTCCCCGTTCGACAGACA数据处理使用2 AC 法计算各mRNA相对表达量，计算公式为ACt=Ct试验组一Ct对照组，Ct=Ct目的基因一Cl内参基因,表达量=2-AC。1.2.3p38MAPK等磷酸化活性检测分组及前处理同1.4，随后将2 4孔细胞培养板置于5%CO2培养箱37 培养1min。收集细胞悬液150 L，在4下2 50 0 r/min离心5min。加人10 0 L细胞裂解液和2 5L5XLoadingbuffer混匀，煮沸5min。常规 Western blot 法检测中性粒细胞 p38MAPK、ERK 和p65NF-B蛋白磷酸化活性，-actin为内参,使用全自动化学发光成像系统灰度分北京农学院学报生物工程（上海）股份有限公司进行合成。具体引物见表1。反应阶段：UDG酶激活阶段50，2min;预变性阶段9 5，2 min；变性阶段9 5,15s；退火及延伸阶段6 0，lmin,共45个循环。表 1 Real-time PCR 引物Tab.1Primers of Real-time PCR150100500Control第39卷反向引物ReversePrimer(53)GACCTTTTCTCCTCCAGATCCTATGAGTTCCTTCAGCCGCTCACCTCGATGTCCTCTTTCTGCGATGCGGCCAAATCCGTTModel析软件对条带进行分析，以目的条带/内参条带表Rolipram 1 mol/L示磷酸化活性。图1咯利普兰对中性粒细胞表达Mac-1的影响1.3统计分析Fig.1 Effect of Rolipram on Mac-1 expression on neutrophils数据以平均值士标准差表示，采用SPSS软件ERK、p 6 5NF-k Bm RNA 表达有极显著促进作用26.0进行Studentst-test分析，统计各组差异显（P 0.0 1），促进率分别为32 1.0 1%、2 2 3.7 1%、著性,P0.05为有统计学意义。Control 组与93.48%;咯利普兰对PMA上调的中性粒细胞p38Model组比较，“#”表示Po.0l；M o d e l组与MAPK、p 6 5NF-Bm RNA 表达有极显著抑制作Rolipram组比较，“*”表示P0.05，“*”表用（P0.01)，抑制率分别为6 2.6 0%、49.8 3%，对示P0.01。口 Control52 结 果42.1口咯利普兰对中性粒细胞表达Mac-1的影响由图1可知,PMA对中性粒细胞表达Mac-1有极显著促进作用（P0.01），促进率为128.15%;咯利普兰对PMA上调中性粒细胞表达Mac-1有一定抑制作用,其中,5 mol/L Rolipram可极显著抑制PMA上调的中性粒细胞表达Mac-1(P0.05）。2.2咯利普兰对中性粒细胞p38MAPK等mRNA表达的影响由图2 可知,PMA对中性粒细胞p38MAPK、Rolipram 5 mol/LModelRolipram 5 mol/L320图2 咯利普兰对中性粒细胞p38MAPK、ERK、p 6 5NF-kBmRNA表达影响Fig.2Effects of Rolipram on mRNA expression of p38MAPK,ERK,p65NF-kBin neutrophilsp38MAPKERKp65 NF-kB2024年第1期引张旭日等：咯利普兰对猪中性粒细胞表达Mac-1的作用及有关信号机制ERKmRNA表达有显著抑制作用（P0.05），抑制率为 2 3.48%。2.3咯利普兰对中性粒细胞p38MAPK等磷酸化活性的影响由图3可知，PMA可极显著促进中性粒细胞p38MAPK、ERK、p 6 5NF-c B磷酸化活性（P口Control1.00.80.60.4F0.20.0图3咯利普兰对中性粒细胞p38MAPK、ERK、p 6 5NF-k B磷酸化活性影响Fig.3 Effects of Rolipram on phosphorylation activity of p38 MAPK,ERK,p65 NF-kB in neutrophils3 讨 论Mac-1是中性粒细胞表达的重要黏附分子，在调控其穿过微血管内皮细胞、进人组织产生炎症反应中起重要作用。研究表明，在血管损伤小鼠模型中,咯利普兰可通过下调中性粒细胞Mac-1活化抑制血管损伤部位中性粒细胞募集15;PDE4抑制剂罗氟司特N-氧化物可抑制fMLP刺激的中性粒细胞表达Mac-1，进而减少白细胞的黏附，缓解炎症16 。试验结果表明，PMA可极显著上调中性粒细胞表达 Mac-1（P 0.0 1),明显优于fMLP对中性粒细胞Mac-1的激活作用。5mol/L Rolipram可明显抑制PMA上调的中性粒细胞表达Mac-1（P 0.0 1,提示咯利普兰的抗炎作用与抑制中性粒细胞表达Mac-1有关。试验表明，2 0 nmol/L、30nmol/L和50 nmol/L的PMA均可显著抑制猪中性粒细胞表达Mac-l,但50 nmol/L的PMA对猪中性粒细胞有一定程度的损伤，而2 0 nmol/L、30nmol/L对细胞无显著影响。咯利普兰是常用的PDE4抑制剂,10 mol/L咯利普兰对人多形核白细胞呼吸爆发具有显著抑制作用，并且对多形核白细胞无明显损伤17 ，常规剂量是安全的。在炎症反应中，Mac-1表达与p38 MAPK、ERK、p 6 5NF-B等信号蛋白紧密相关，如乙酰紫堇灵可通过抑制脂多糖刺激的小胶质细胞p38MAPK磷酸化活性，下调Mac-1水平，降低小胶质550.01），促进率分别为56 49 6%、10 2 0.0 2%、60.07%;Rolipram可极显著抑制PMA上调的中性粒细胞p38MAPK、ERK、p 6 5NF-B磷酸化活性（P 0.0 1），抑制率分别为6 5.54%、12.7 2%、42.95%。ModelRolipram 5 mol/Lp38MAPKERKControlModelRolipramp38MAPK-actinERK-actinp65 NF-kB-actinp65 NF-KB细胞分泌的促炎介质，缓解局部炎症反应18 ；大肠杆菌和中性粒细胞共培养能显著促进ERK1/2的磷酸化，使 Mac-1 转为高亲和力构象，而ERK1/2上游的Meki抑制剂PD98059可导致中性粒细胞吞噬功能下降19；宁心涤痰汤可通过下调低密度脂蛋白上调的巨噬细胞泡沫化模型p65NF-kB蛋白磷酸化水平进而抑制Mac-1表达，缓解经皮冠状动脉介人术所导致的慢性持续性的炎症反应2 0 1。p38MAPK是丝裂原活化蛋白激酶（MAPK)信号通路的一条重要途径，主要参与调控炎症反应。生理条件下，p38 MAPK活性很低，被细胞因子激活后，可促进 TNF-、I L-1、I L-6、I L-8 等的产生，增强炎症反应2 1-2 2 。研究表明,PDE4抑制剂可参与p38MAPK信号通路的调控：罗氟普仑可通过抑制A25-35上调的阿尔茨海默病模型大鼠海马内p38 MAPK蛋白磷酸化和减少炎性因子表达,改善痴呆大鼠的学习记忆功能障碍和神经炎症2 3；FCPR03对脂多糖诱导的抑郁模型小鼠,可降低皮质和海马内p-p38和应激活化蛋白激酶的磷酸化水平,抑制NF-cB的活化及炎症因子的释放,降低中枢神经炎症2 41。本试验表明，咯利普兰可极显著抑制PMA上调的中性粒细胞p38MAPKmRNA表达和磷酸化活性,其中,咯利普兰对中性粒细胞p38MAPK磷酸化活性抑制作用比前期结果5更明显，可能与更换特异性致炎因子及高浓度咯利普兰有关。56ERK属于MAPK家族，参与多种细胞功能调控，包括生长、增殖、分化和凋亡等2 51。ERK活化可促进炎症发生，还可进一步激活NF-kB,增加促炎细胞因子的释放2 6-2 7 。研究表明PDE4 抑制剂可参与ERK信号通路的调控：欧前胡素通过升高cAMP/PKA来抑制Akt和ERK磷酸化，进而抑制人中性粒细胞黏附和迁移2 8 ；咯利普兰可通过抑制人外周血单核细胞ERK1/2磷酸化活性阻断粉尘螨刺激的单核细胞IL-5表达，提示其通过ERK信号途径抑制免疫活性细胞的活化2 9。该试验结果表明,咯利普兰可明显抑制PMA上调的中性粒细胞ERK mRNA表达（P0.05）和磷酸化活性(P0.01)。p65NF-cB属NF-kB家族成员，在炎症疾病的发生和发展过程中发挥着关键作用30-32 。cAMP-PDE选择性中药的抗炎作用主要与抑制NF-kB途径有关33，咯利普兰可参与NF-kB信号通路的调控：如咯利普兰可减少脂多糖刺激的败血症模型小鼠血清中炎症因子的产生并抑制肺损伤,其机制与抑制MAPK和NF-kB信号通路有关341；咯利普兰还可抑制完全弗氏佐剂上调的佐剂关节炎模型大鼠肺组织NF-kB表达，减轻佐剂关节炎模型大鼠肺损伤35。该试验结果表明，咯利普兰可极显著抑制PMA上调的中性粒细胞 p65 NF-cBmRNA 表达和磷酸化活性(P0.01)。综上所述，咯利普兰可抑制中性粒细胞表达Mac-1,其机制与阻遏p38MAPK、ERK 和p65NF-kBmRNA表达及磷酸化活性有关。参考文献：1 LEFKIMMIATIS K,ZACCOLO M.cAMP signaling in sub-cellular compartmentsJJ.Pharmacology and Therapeutics,2014,143(3):295-304.2王志旺，杜玥，李济阳，等.cAMP/Epac信号通路调控慢性咳嗽及中药干预作用研究进展J.中国现代应用药学，2 0 2 3，40(19):2738-2744.3 JA CO B C,M A RT I N-CH O U LY C,LA G ENT E V.T y p e 4phosphodiesterase-dependent pathways:role in inflammatoryprocessesJJ.Therapie,2002,57(2):163-168.4 J JI J,LIU Z,HONG X,et al.,Protective effects of rolipram onendotoxic cardiac dysfunction via inhibition of the inflamma-tory response in cardiac fibroblastsJJ.BMC CardiovascularDisorders,2020,20(1):242.5杨晨，王俊，黄林，等.咯利普兰通过NF-cB抑制MRP8/14在RAW264.7细胞中促炎性因子的释放JI.中国病理生理杂志，2 0 17,33(6)：10 9 8-110 3.6 J JACOB C,MARTIN-CHOULY C,LAGENTE V.Type 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