白鲜碱通过铁死亡途径抑制结肠癌细胞生长的探究.pdf
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1、中文科技期刊数据库(全文版)医药卫生 收稿日期:2023 年 12 月 21 日 作者简介:纪莲如,(1997),女,汉族,广东揭阳人,毕业于江西中医药大学,硕士研究生学历,药学专业,研究方向为药理学。-163-白鲜碱通过铁死亡途径抑制结肠癌细胞生长的探究 纪莲如 江西中医药大学,江西 南昌 330004 摘要:摘要:目的 探究白鲜碱通过铁死亡途径抑制结肠癌细胞的生长及相关机制研究。方法 采用 CCK-8 试剂盒检测梯度浓度的白鲜碱对结肠癌细胞(SW480)增殖的影响。通过荧光探针法(C11-BODIPY 581/591 探针、DCFH-DA 探针)检测白鲜碱对结肠癌细胞的脂质过氧化和活性氧(
2、ROS)水平的影响。使用 western blot 实验检测结肠癌细胞内与铁死亡相关的 GPX4、SLC7A11、HO-1 蛋白的变化。结果 与空白对照组相比,白鲜碱的剂量增加抑制了结肠癌细胞的细胞增殖(P0.05)。C11-BODIPY 581/591 探针染色实验结果显示,在加入白鲜碱后 SW480 细胞中脂质过氧化探针的还原型相对荧光强度减弱(P0.05),活性氧荧光探针(DCFH-DA)实验结果显示白鲜碱浓度增大,SW480 中 ROS 相对荧光强度增加(P0.05)。Western blot 实验检测结果显示白鲜碱浓度增加,GPX4、HO-1、SLC7A11 蛋白表达水平降低(P0.
3、05)。结论 白鲜碱以剂量依赖性促进结肠癌细胞(SW480)发生铁死亡,同时引起 SW480 细胞脂质过氧化水平增加,铁死亡负性调控相关蛋白 GPX4、HO-1、SLC7A11 表达水平降低。关键词:关键词:白鲜碱;铁死亡;结肠癌;SW480 细胞 中图分类号:中图分类号:R2-0 铁死亡(FerroPtosis)是一种具有铁依赖性,区别于细胞凋亡、细胞坏死、细胞自噬的新型的细胞程序性死亡方式,在诱导肿瘤细胞死亡方面有广阔的应用前景1。铁死亡是依赖于铁介导的、主要通过脂质过氧化水平和活性氧水平的增加的相关细胞机制,同时还与谷胱甘肽的耗竭相关。在正常细胞中,维持细胞的氧化还原的动态平衡是一个重要
4、的细胞保护机制,因此,在抗肿瘤的机制作用研究中,诱导肿瘤细胞发生铁死亡是一条有效的路径。随着中国经济的高速发展,人们的生活水平大大提高,我国结肠癌发病率和死亡率也呈现上升趋势。越来越多的研究表明,结肠癌可以通过多靶点和多通路的天然药物杀伤癌细胞或者抑制肿瘤细胞的生长。白鲜碱(Dictamine)是一种从传统中药白鲜皮中分离纯化得到的化合物,有研究发现白鲜碱对非小细胞肺癌具有一定的抑制作用2,但其在抗结肠癌的作用机制尚无报道。随着铁死亡与肿瘤细胞的联系得到越来越多的报道,尤其在铁死亡与消化系统肿瘤的关系也存在研究的潜质,临床上目前的消化系统肿瘤主要以化疗为主,其中化疗药物的应用对患者的机体损伤存
5、在较大的联系,因此,通过中药提取的药物单体对结肠癌的治疗具有重要意义。本研究从铁死亡角度对白鲜碱通过铁死亡途径抑制结肠癌细胞生长的作用进行浅层的机制探讨。1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 细胞 人结肠癌细胞系 SW480 细胞购自上海中科院细胞库。药品和试剂:白鲜碱(货号:HY-N0849)购自MedChemExPress 公司。优质胎牛血清购自上海翌圣生物公司。1640 RPMI 培养基购自北京索莱宝公司。CCK-8细胞增殖毒性试剂盒购自大连美仑生物公司。C11-BODIPY 581/591 探针和 DCFH-DA 探针购自美国赛默飞公司。HRP 标记山羊抗鼠二抗,抗兔二抗购自杭州华
6、安生物公司。兔抗人 GPX4、SLC7A11、HO-1 抗体购自上海 Abcam 公司。鼠抗人-actin 抗体购自北京全式金公司。仪器:Fluoroskan 型多功能酶标仪,美国赛默飞公司;DM IL倒置荧光显微镜,德国徕卡公司;蛋白电泳仪和化学成像系统,美国伯乐公司。1.2 实验方法 1.2.1 细胞培养 SW480 细胞经过复苏后,使用含 10 优质胎牛血清和 1 双抗的 1640 RPMI 培养基中进行培养,置于中文科技期刊数据库(全文版)医药卫生-164-37、5 CO2的细胞培养箱中进行培养,当细胞铺满培养瓶底约 70 80 左右进行传代培养,使用对数生长期的细胞进行实验。1.2.
7、2 CCK-8 试剂盒测定细胞增殖活性 将处于对数生长期的SW480细胞经过消化、收集、离心后,使用1mL 含10胎牛血清的培养基进行重悬,并进行计数,96 孔板以 5104个/mL 的细胞密度,每孔 100 L 进行种板,待细胞贴壁且长至 60,每孔加预先配制并涡旋混匀的相应浓度(3、10、30 M的白鲜碱)的药物稀释液,放入培养箱中培养 24 h,随后,向每孔加入 10 L CCK-8 试剂,放回培养箱避光孵育 2 h 后使用酶标仪在 450 nm 的波长下进行各孔的吸光度值测定,根据细胞活力度公式:Viability()=(OD 药物组-OD 空白组)/(OD 对照组-OD 空白组)10
8、0,实验重复三次,使用 Prism 软件进行统计学分析和作图。1.2.3 C11-BODIPY 581/591 荧光探针检测细胞脂质过氧化水平 将对数生长期的 SW480 细胞以 5104 个/mL 接种与 96 孔板中,待细胞融合至 6070,分别使用含1 优质胎牛血清的 1640 PRMI 培养基和分别含 3、10、30 M 的白鲜碱药液的 1 优质胎牛血清的 1640 PRMI 培养基替换原有的细胞培养基,37 孵育24 h 后,将配制好的 10 mM C11 BODIPY C581/591 原液进行稀释,取 0.5 L 10 mM 的 C11 BODIPY C581/591 原液稀释于
9、 2500 L 的 HBSS 缓冲液中,以每孔 100L 替换掉原始的药液和培养基,避光孵育 20 min,使用倒置荧光显微镜观察并进行拍照。实验重复三次,使用 Image J 软件对荧光强度进行定量统计,使用Prism 软件进行统计学分析和作图。1.2.4 活性氧荧光探针(DCFH-DA)检测细胞 ROS 水平 细胞接种及加药实验操作同 1.2.3,将 1000的DCFH-DA 原液进行稀释,取 1.5 L 1000的 DCFH-DA原液稀释于1500 L的HBSS缓冲液中,以每孔100 L 替换掉原始的药液和培养基,避光孵育 30 min,使用倒置荧光显微镜进行拍照。实验重复三次,使用Im
10、age J 软件对荧光强度进行定量统计,使用 Prism软件进行统计学分析和作图。1.2.5 蛋白免疫印迹实验检测铁死亡相关蛋白表达水平 对数生长期的 SW480 细胞接种到 1 优质胎牛血清的 1640 PRMI 培养基和分别含 3、10、30 M 的白鲜碱药液的 1 优质胎牛血清的 1640 PRMI 培养基中,孵育 24 h,随后提取细胞蛋白,于冰上将四组细胞进行收集并裂解和蛋白定量,使用 10 SDS-PAGE 凝胶,设置电泳电压为 90 V 进行蛋白分离,随后使用 PVDF 膜进行转膜,100 V,转膜 100 min,5 脱脂奶粉封闭 2 h,1TBST 洗膜三次,随后加入稀释的一
11、抗溶液 GPX4(1:1000)、SLC7A11(1:1000)、HO-1(1:1000)、-actin(1:5000)在 4 下孵育过夜,次日回收一抗溶液,1TBST 洗膜三次,加入对应来源的二抗稀释液(1:10000)于室温摇床孵育 1 h,再次洗膜三次,通过 Bio-Rad 化学成像系统检测蛋白表达情况。实验重复三次,Image J 软件对蛋白表达灰度进行定量统计,使用Prism软件进行统计学分析和作图。1.3 统计学方法 本实验均采用平均值标准差(即x SD)表示计量数据,实验进行三次重复实验,采用 Prism 软件对所有数据进行统计分析,首先将计量数据进行方差齐性检验,符合方差齐性和
12、正态分布的情况下,多组数据和两组数据间差异分别采用统计分析方法为单因素方差分析(One-Way ANOVA)和两独立样本均数 t 检验(Tow-simPle T-test);不符合方差齐性的情况则两组数据间和多组数据分别采用 Wilcoxon 秩和检验和Kruskal-Wallis 检验,当上述统计结果为*P0.05,*P0.01,*P0.001,*P0.0001 表明存在统计学显著性。使用 Prism 软件对数据进行作图。2 结果 2.1 白鲜碱抑制 SW480 细胞增殖 与对照组相比,通过白鲜碱处理后的 SW480 细胞的活性明显下降。其中 3 M、10 M 浓度组对 SW480细胞的毒性
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