MiR-423-5p、Beclin-1及LC3-B在大鼠急性肾损伤中的表达及意义.pdf
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1、中文科技期刊数据库(全文版)医药卫生 收稿日期:2023 年 12 月 21 日 作者简介:郭秀全(1983),男,汉族,山东日照人;姚常雷(1983),男,汉族,山东日照人。-209-MiR-423-5p、Beclin-1 及 LC3-B 在大鼠急性肾损伤中的表达及意义 郭秀全1 卢绪楼2 来庆国1 苏 磊1 姚常雷1(通讯作者)1.日照市人民医院泌尿外科,山东 日照 276800 2.日照市人民医院生殖医学科,山东 日照 276800 摘要:摘要:目的 研究大鼠急性肾损伤后 miR-423-5p、Beclin-1 以及 LC3-B 的相关性及意义。方法 24 只大鼠随机分为 2 组,假手术
2、组 6 只(Sham 组);缺血再灌注组 18 只(I/R 组),分别在肾缺血再灌注 12h、24h、48h 三个时间点取血液及肾脏标本,通过荧光实时定量 PCR 技术测量 miR-423-5p,HE 法观察急性肾损伤后病理变化,透射电镜查找自噬体,通过免疫组化法分析 Beclin-1以及 LC3-B表达的变化,检测血浆尿素氮(BUN)以及血清肌酐(SCR)的含量变化,采用 Pearson 法分析 miR-423-5p 与肾功能变化、Beclin-1 以及 LC3-B 的相关性。结果 I/R 组肾功能损伤更加严重,血 BUN 和 SCR 的含量明显升高(P0.05),肾损伤 12h 后可观测到
3、自噬体,检测到 miR-423-5p、Beclin-1 及 LC3-B 表达显著增高(P0.05),且 miR-423-5p 与 Beclin1、LC3-B 的表达量均呈显著正相关。结论 大鼠肾缺血再灌注急性损伤后肾组织中自噬显著增强,血清 miR-423-5p 表达升高,自噬相关蛋白升高,且两者之间密切正相关。关键词:关键词:miR-423-5p;Beclin-1;LC3-B;自噬;急性肾损伤 中图分类号:中图分类号:R541 Expression and significance of MiR-423-5p,Beclin-1 and LC3-B in rats with acute kid
4、ney injury GUO Xiuquan1 LU Xuoulou2 LAI Qingguo1 SU Lei1 YAO Changle1(Corresponding author)1.Department of Urology,Rizhao Peoples Hospital,Shandong Rizhao 276800 2.Department of Reproductive Medicine,Rizhao Peoples Hospital,Shandong Rizhao 276800 Abstract:Objective To investigate the expression and
5、significance of miR-423-5p,autophagy related gene Beclin-1 and microtubule associated protein 1 light chain 3B(LC3-B)in renal tissue after acute renal ischemia-reperfusion injury in rats.Methods 24 rats were randomly divided into 2 groups.Sham group(n=6);Ischemia-reperfusion group(n=18);Blood and ki
6、dney samples were collected in each group at three corresponding time points 12h,24h and 48h after renal ischemia-reperfusion.miR-423-5p was measured by real-time quantitative fluorescent PCR technology,the contents of plasma urea nitrogen(BUN)and serum creatinine(SCR)of rats were detected by bioche
7、mical analyzer,pathological changes of renal were observed by HE staining.Autophagy in renal tissue was observed by transmission electron microscopy,the expression of Beclin-1 and LC3-B in renal autophagy was detected by immunohistochemistry,and the correlation of miR-423-5p with renal function and
8、autophagy related proteins was analyzed by Pearson method.Results Compared with Sham group,kidney injury was significantly increased in I/R group,and blood BUN and SCR contents were significantly increased(P0.05).Autophagosomes were observed 12h after kidney injury,and expressions of miR-423-5p,Becl
9、in-1 and LC3-B were significantly increased(P0.05).The expression levels of miR-423-5p were 中文科技期刊数据库(全文版)医药卫生-210-positively correlated with Beclin1 and LC3-B(r=0.768 and 0.722,respectively,P 0.05).Conclusion Autophagy is significantly enhanced in renal tissue after acute renal ischemia-reperfusion
10、 injury,and serum miR-423-5p expression and autophagy related protein are increased,and there is a close positive correlation between them.Key words:miR-423-5p;Beclin-1;LC3-B;Autophagy;Acute kidney injury 0 引言 急性肾损伤(Acute Kidney Injury,AKI)是短时间内各种原因引起肾功能急剧受损,排泄功能迅速降低,机体内环境出现严重紊乱的病理过程1,具有较高的发病率,缺血再灌注
11、损伤是急性肾损伤最常见病因。自噬是机体细胞受到各种外界刺激引起损伤后,通过溶酶体将细胞内损伤或者变性的物质降解的程序化生物学过程2 微小 RNA(microRNA,miRNA)属于内源性非编码单链 RNA 分子,可降解 mRNA,抑制蛋白翻译,并可调节细胞生长和凋亡等生物学行为,参与多种生理病理过 程,研 究 表 明 miRNA 与 AKI 严 重 程 度 相 关3,miR-423-5p 是自噬的正调节因子,表达沉默可通过抑制细胞凋亡保护缺血再灌注损伤4,miR-423-5p 在 AKI 过程中高表达,其在肾细胞凋亡中的作用尚不清楚。本实验通过大鼠急性肾损伤模型的建立,研究miR-423-5p
12、 在大鼠急性肾损伤后肾损伤的相关性以及意义。1 材料与方法 1.1 主要试剂及仪器 兰州大学提供 24 只雄性 SD 大鼠(25030g),使用许可证:SYXK(甘)2009-0005;生产许可证:SCXK(甘)2009-0004,常规饲养,温度 2225,湿度 40%65%。RNA 逆转录试剂盒(加拿大 Fermentas),Trizol(美国 Invitrogen),SYBR Green Real-time PCR 试剂盒(大连 TaKaRa)兔抗 LC3-B 多克隆抗体(bs-4843R)(北京博奥森),兔抗Beclin-1多克隆抗体(bs-1353R)(北京博奥森),DAB 显色试剂盒
13、(ZLI9018-3)(北京中杉金桥),SP 免疫组化检测试剂盒(SP-9001)(北京中杉金桥),图像分析系统(日本 Olympus),透射电镜(JEM-1230),AU800 全自动生化分析仪,其余设备用自兰州大学第二临床医院动物实验中心及中心实验室。1.2 动物分组及 AKI 模型建立 将 24 只 SD 大鼠随机分组。腔内注射法麻醉(戊巴比妥钠,35mg/kg),麻醉完全后正中切口开腹分离双侧肾蒂,血管钳分别夹闭双侧肾动脉,可见肾表面颜色由鲜红变为苍白色。其中假手术组(Sham 组,n=6):只分离肾动脉血管,不夹闭,在观察 40min 后关闭大鼠腹部切口;缺血再灌注组(I/R 组,n
14、=18):夹闭双侧肾动脉,持续夹闭血管 40min 后,恢复肾血流,关闭腹部;在手术过程在恒温台上操作,术后送回饲养笼自由饮食。各组于再灌注后 12h、24h、48h 三个时间点处死大鼠,取血浆及肾脏标本。1.3 肾组织形态学观察 在大鼠被处死后取肾组织,常规病理处理,在光镜下观察肾组织形态学变化。1.4 检测血浆中血尿素氮(BUN)和血清肌酐(SCR)取处死后大鼠血浆检测血尿素氮(BUN)和血清肌酐(SCR)的含量。1.5 肾组织中 miR-423-5p 表达水平检测 用 Trizol 试剂提取肾组织中总 RNA,合成 cDNA通过 PCR 扩增,得到目的基因的循环阈值,正向引物 5 CGA
15、AGTTCCCTTTGTCATCCT3,反向引物 5GTGCAGGGTCCGAGGTATTC3(上海生工生物合成)。1.6 透射电镜观察自噬体 经戊二醛固定处理后肾组织,再间隔 10 分钟漂洗两次,再经锇酸固定、梯度脱水后包埋、切片定位、铀染、铅染,最后电镜观察。1.7 免疫组织化学法检测 Beclin-1 及 LC3-B 免疫组化检测采用 SP 法,阳性结果的判定:细胞质内发现棕褐色颗粒判定为阳性。阳性结果由与本实验无关的两位病理科高年资医生于光镜下随机观察并摄片统计,图片用图像分析软件处理,用平均光密度值(mean density)反映自噬蛋白表达强度。1.8 荧光实时定量 PCR 检测
16、将肾组织剪碎后滴加 Trizol 试剂后研磨,使用试剂盒来提取肾组织总 RNA,然后逆转录为 cDNA,SYBR Green Supermix 试剂盒检测肾组织中 miR-423-5p 的中文科技期刊数据库(全文版)医药卫生-211-表达量,使用 U6 作为内参,对目的基因 mRNA 表达进行定量分析。1.9 统计学处理 数据以平均值标准差(s)表示,用 SPSS 21.0统计软件进行t检验,Pearson 法对相关性进行分析。以 P0.05 为有统计学意义。2 结果 2.1 HE 染色病理 本实验 I/R 组大鼠在造模后,部分肾小球萎缩,球囊腔内出现空隙,空隙随缺血缺氧时间延长而增大,可见部
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