抗CCL20单克隆抗体对血清淀粉样蛋白A相关的结节病中促炎性细胞因子的抑制作用.pdf
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1、论著(基础研究)抗 CCL20 单克隆抗体对血清淀粉样蛋白 A 相关的结节病中促炎性细胞因子的抑制作用魏 佳,马成星,郑 颖,那雨琪,丁晶晶 摘要 目的 探讨抗 CCL20 单克隆抗体是否可抑制高水平血清淀粉样蛋白 A(SAA)相关的结节病外周血单个核细胞(PBMC)中促炎性细胞因子的表达。方法提取健康人和结节病患者的 PBMC,并进行分组。除空白对照组(正常人 PB-MC)和结节病 PBMC 对照组(患者 PBMC)外,另将结节病组 PBMC 中分别加入 SAA、SAA+抗 CCL20 单克隆抗体、SAA+NF-B抑制剂 BAY11-7082 或地塞米松,经培养 48 h 后收集各组细胞,分
2、别作为 PBMC+SAA 刺激组、PBMC+SAA+NF-B 抑制剂BAY11-7082 组、PBMC+SAA+抗 CCL20 单抗组、PBMC+地塞米松干预组,使用 ELISA 分别测定各组细胞上清液中细胞因子 IL-17A、IL-23、IL-6、CCL20 和 TGF-1的表达,使用 RT-PCR 测定各组细胞中 CCR6、IL-17、ROR-t 和 Foxp3 的 mRNA 表达水平,使用 Western blot 检测各组细胞中 p-NF-B 和 NF-B 蛋白的表达水平。结果PBMC+SAA+抗 CCL20 单抗组与 PBMC+SAA组相比,细胞上清液中的 IL-17A、IL-23
3、和 IL-6 的水平显著降低(P0.01),而 TGF-1的含量显著升高(P0.01)。PBMC+SAA+抗 CCL20 单抗组相较于 PBMC+SAA 组,细胞中 CCR6、IL-17A、ROR-tmRNA 水平显著降低(P0.05)。PBMC+SAA+抗 CCL20 单抗组中 p-NF-B 蛋白表达水平较 PBMC+SAA 组明显降低(P0.01)。结论 抗 CCL20 单克隆抗体可抑制高水平 SAA 相关的结节病 PBMC 中促炎性细胞因子的表达。关键词 结节病;血清淀粉样蛋白 A;核因子 B;抗 CCL20 单克隆抗体 中图分类号 R392 文献标志码 A 文章编号 2097-2768
4、(2024)01-0001-06 DOI 10.16571/ki.2097-2768.2024.01.001基金项目:国家自然科学基金(82170077);南京市医药卫生科研课题(YKK20051)作者单位:210008 南京,南京中医药大学鼓楼临床医学院呼吸与危重症医学科(魏 佳、丁晶晶);210008南京,南京大学医学院附属鼓楼医院呼吸与危重症医学科(马成星);210008 南京,南京医科大学鼓楼临床医学院呼吸与危重症医学科(郑 颖、那雨琪)通信作者:丁晶晶,E-mail:dingflower Anti-CCL20 monoclonal antibody suppresses the ov
5、erexpression of pro-inflammatory cytokines in sarcoido-sis accompanied by serum amyloid AWEI Jia1,MA Chengxing2,ZHENG Ying 3,NA Yuqi 3,DING Jingjing 1(1.Department of Respiratory and Critical Care Medicine,Nanjing Drum Tower Hospital,Clinical College of Nan-jing University of Chinese Medicine,Nanjin
6、g 210008,Jiangsu,China;2.Department of Respiratory and Critical Care Medicine,Nanjing Drum Tower Hospital,The Affiliated Hospital of Nanjing University Medical School,Nanjing 210008,Jiangsu,China;3.Department of Respiratory and Critical Care Medicine,Nanjing Drum Tower Hospital,Clinical College of N
7、anjing Medical University,Nanjing 210008,Jiangsu,China)Abstract Objective This study aims to investigate whether the anti-CCL20 monoclonal antibody inhibits the expression of pro-inflammatory cytokines in peripheral blood mononuclear cells(PBMCs)with high levels of serum amyloid A(SAA)associated wit
8、h sarcoidosis.Methods PBMCs were extracted from both healthy individuals and patients with sarcoidosis.In addition to the blank control group and the sarcoidosis PBMC controlgroup,the PB-MCs from the sarcoidosis group were separately treated with SAA,SAA+anti-CCL20 monoclonal antibody,SAA+NF-B inhib
9、itor BAY11-7082,or dexamethasone.After cell culture for 48 hours,cells from each group were collected.The expression levels of cyto-kines(IL-17A,IL-23,IL-6,CCL20,and TGF-1)in the cell su-pernatant were determined using ELISA.The mRNA expression levels 1医学研究与战创伤救治2024 年1 月 第37 卷 第1 期 J Med Res Combat
10、 Trauma Care,Vol.37,No.1,January,2024of CCR6,IL-17,ROR-t,and Foxp3 in the cells were assessed using RT-PCR.The protein expression levels of p-NF-B and NF-B in the cells were examined by Western blot.Results In the PBMC+SAA+anti-CCL20 monoclonal antibody group,the levels of IL-17A,IL-23,and IL-6 in t
11、he culture supernatant were significantly decreased compared to that in the PBMC+SAA group(P0.01),while TGF-1 content was significantly increased(P0.01).In comparison to the PBMC+SAA group,the PBMC+SAA+anti-CCL20 monoclonal antibody group exhibited a significant reduction in the mRNA levels of CCR6,
12、IL-17A,and ROR-t(P0.05).The expression level of p-NF-B protein in the PBMC+SAA+anti-CCL20 monoclonal antibody group was significantly lower than that in the PBMC+SAA group(P0.01).Conclusion Anti-CCL20 monoclonal antibod-y can effectively inhibit the expression of pro-inflammatory cytokines in sarcoi
13、dosis PBMCs with elevated levels of SAA.Key words sarcoidosis;serum amyloid A;nuclear factor B;anti-CCL20 monoclonal antibody0 引 言 结节病是一种病因不明的系统性炎症性疾病,可累及体内几乎所有的器官,其典型病理特征是非干酪样肉芽肿的形成1。结节病以中青年发病为主,平均发病年龄约为 50 岁,女性发病率略高于男性,约有 10%30%的患者表现为慢性、进展性病程,最终发生不可逆的肺纤维化2-3。目前,临床上尚缺乏结节病的特异性检验标志物和有针对性的治疗方法,这使得对结节病
14、的管理仍然具有挑战性4。血清淀粉样蛋白 A(serumamyloid A,SAA)是一种由肝脏合成的急性时相反应蛋白,在结节病的肉芽肿组织和外周血中异常增高5-6。SAA 可以上调趋化因子配体 20(C-C motif chemokine ligand 20,CCL20)的表达,CCL20 是一种趋化因子,可选择性地吸引树突状细胞、效应/记忆 T 淋巴细胞和幼稚 B 细胞,其通过结合和激活趋化因子受体 6(che-mokine receptor 6,CCR6),诱导 Treg 细胞和 Th17 细胞的迁移7-8。结节病中存在 CCR6/CCL20 趋化因子轴异常激活,CCR6 在结节病肺组织中
15、的 Th17 淋巴细胞上高表达,并通过其与配体 CCL20 的相互作用而调节 Th17 细胞的功能9-10。抗 CCL20 单克隆抗体可通过与淋巴细胞中的 CCR6 结合,纠正失衡的 Th1/Th2 与 Th17/Treg 细 胞 反 应11。但 抗CCL20 单克隆抗体对结节病外周血单个核细胞(pe-ripheral blood mononuclear cells,PBMC)中 Th17 相关的免疫紊乱是否有作用,其作用机制是否与 SAA的高表达相关,目前尚不明确。本研究旨在探讨抗CCL20 单克隆抗体是否能缓解结节病 PBMC 中Th17 相关的的促炎性细胞因子的表达,且其作用是否与高水平
16、的 SAA 作用相关,以便于更深入地了解结节病的发病机制,为其治疗提供支持。1 材料与方法1.1 主要仪器与试剂人淋巴细胞分离液(索莱宝,P8900-200),SAA(SIGMA,SRP4324),BAY11-7082(BAY),CCL20 单抗(RD,AF360-SP),地塞米松(凯基,KGP11100)。人 TGF-1 ELISA 试剂盒(批号:EH010-48),人 IL-23ELISA 试剂盒(批号:EH035-48),人 IL-6ELISA 试剂盒(批号:EH004-48),人 IL-17A ELISA 试剂盒(批号:EHC170.48),人 CCL20 ELISA 试 剂 盒(批
17、号:HM10367),人HMGB1 ELISA 试剂盒(批号:SEA399Hu)。Trizol(Aidlab,252250AX),HiScript Q RT SuperMix for qPCR(Q223-01),ChamQ Universal SYBR qPCR Mas-ter Mix(Q711-02)购于南京诺唯赞生物科技股份有限公司。RORt Antibody(Abcam,ab113434),p-STAT3 Antibody(Abcam,ab76315),p-p85 Antibody(CST,4228T),-actin Antibody(Abcam,ab8226),HRP 标记二抗(碧云天
18、),RIPA 细胞快速裂解液(Solarbio,R0010),BCA 蛋白定量试剂盒(Thermos,PICPI23223),蛋 白 预 染Marker(Fermentas,SM1811)。引物序列见表 1。表 1 RT-PCR 所用引物序列Table 1 Primer sequences used in RT-PCR基因序列CCR6 ForwardCTGTGCTCTATGCTTTTATTGGG ReverseCATTGTCGTTATCTGCGGTCTCIL-17A ForwardCAGACTACCTCAACCGTTCCAC ReverseTCCAGCTTTCCCTCCGCATTGAROR-t
19、 ForwardTACCTTGGCCAAAACAGAGG ReverseGATGCCTGGTTTCCTCAAAAFoxp3 ForwardCCTGGTTGTGAGAAGGTCTTCG ReverseTGCTCCAGAGACTGCACCACTTGAPDH ForwardGGAGCGAGATCCCTCCAAAAT ReverseGGCTGTTGTCATACTTCTCATGG1.2 细胞分组与培养1.2.1PBMC的提取取正常人与结节病患者静脉血各 6 份,每份 20 mL 置于抗凝管内,于 2 h 内2医学研究与战创伤救治2024 年1 月 第37 卷 第1 期 J Med Res Combat
20、Trauma Care,Vol.37,No.1,January,2024分离获取 PBMC,步骤如下:将 20 mL 全血置于 50 mL 无菌离心管内,加入等体积的 1PBS,混匀。取 15 mL 无菌离心管 8 支,各管内加入 5 mL 淋巴细胞分离液。分别取 5 mL 稀释的全血缓慢加入各管淋巴细胞分离液中,切勿破坏液面。室温下以离心半径 10 cm、2000 r/min 离心 20 min。离心后管内分成上中下 4 层,小心吸取上中层界面中间的白色云雾层,即为 PBMC。吸取 PBMC 至灭菌离心管中,使用 1PBS 洗涤,以离心半径 10 cm、室温下 1000 r/min 离心 1
21、0 min 后弃去上清,重复清洗两次。正常人与结节病患者 PBMC 由南京鼓楼医院提供,伦理号(2016-138-01)。1.2.2PBMC的分组与处理将所提取的 PBMC以每孔 1105/cm2接种于 6 孔板中,并进行如下分组(n=6):空白对照组:即正常人 PBMC;PBMC对照组:即患者 PBMC;PBMC+SAA 刺激组:患者PBMC 中加入 5 g/mL SAA 进行共培养;PBMC+SAA+NF-B 抑制剂 BAY11-7082 组:患者 PBMC 中加入 5 g/mL SAA 和 1 ng/mL BAY11-7082 进行共培养;PBMC+SAA+抗 CCL20 单抗组:患者
22、PBMC中加入 5 g/mL SAA 和 0.5 ng/mL 抗 CCL20 单抗进行共培养;PBMC+地塞米松干预组:患者 PBMC中加入 1 mol/L 地塞米松进行共培养。各组细胞置于含有 1%的青霉素链霉素以及 20%胎牛血清(FBS)的 DMEM 培养基中,37、5%CO2的培养箱中分别培养 48 h。1.3酶联免疫吸附实验检测 IL-17A、IL-6、IL-23、CCL20 及 TGF-1水平收集各组细胞上清培养液,随后按照试剂盒说明书分别检测与 Th17 细胞相关的促炎性细胞因子 IL-17A、IL-6、IL-23、CCL20 及TGF-1的水平,使用多功能酶标仪于 450nm
23、处测定吸光度,实验重复进行 3 次。1.4逆转录定量 PCR(RT-qPCR)使用 Trizol(Aidlab)从各组细胞中提取总 RNA。按反转录试剂盒说明书,以总 RNA 为模板,将 mRNA 反转录为cDNA,反应条件为50 15 min,85 5s。以 cDNA为模板构建 PT-PCR 反应体系,95 30 s,95 10 s,60 30 s,40 个循环,引物序列见表 1。用 GAP-DH 作为内参,采用 2-ct法计算 mRNA 的表达量。1.5 蛋白质免疫印迹检测 收集培养 48 h 后的各组细胞,用含有 1%PMSF 的 RIPA 裂解缓冲液裂解细胞,提取蛋白。使用 BCA 试
24、剂盒测定蛋白浓度。进行上样,电泳,转膜,封闭,一抗孵育过夜(p-NF-B-p65 稀 释 比 为 1 1000,-actin 稀 释 比 例 为1 5000),TBST 缓冲液洗涤 3 次,每次 5 min;与HRP 标记的二抗(15000)室温孵育 1 h,TBST 洗涤3 次后,用 ECL 发光液进行曝光,用 ImageJ 软件分析条带的灰度值。实验重复进行 3 次。1.6统计学分析采用 GraphPad Prism 9.0 统计进行统计分析,定量资料以均数标准差(xs)表示,多组间比较采用单因素方差分析,使用 Tukey 检验方法进行两两比较。以 P0.05 为差异具有统计学意义。2 结
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