蚱蝉虫生真菌的分离鉴定及其抗菌活性.pdf
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1、基金项目:大学生创新创业训练计划项目(,)通信作者:刘德胜,:蚱蝉虫生真菌的分离鉴定及其抗菌活性王佳丽刘笑晗田晓琳汲蕾郭劲帆刘为忠刘德胜滨州医学院药学院山东 烟台 ;滨州医学院临床医学院山东 烟台 【摘要】目的对蚱蝉的虫生真菌进行分离鉴定,初步探索其虫生真菌的种类多样性及真菌的抗菌活性。方法采用组织切块法分离纯化蚱蝉虫生真菌,形态特征学和 序列鉴定所得真菌种属,并用 软件以邻接法构建系统发育树。以氯霉素为阳性对照药物,滤纸片法筛选具有抗菌活性的真菌。结果从蚱蝉中分离得 株真菌,比对分析确定了 株真菌属于 属,分为曲霉属、链格孢属、枝孢子虫属、镰刀菌属、青霉属、苜蓿属、亚罗酵母属。编号为 、对金
2、黄色葡萄球菌、大肠肝菌、变形杆菌、白色念珠菌有显著的抑菌活性,鉴定为 、。结论研究初步探索了蚱蝉虫生真菌的种类,为其虫生真菌资源和次级代谢产物方面的研究奠定基础。【关键词】蚱蝉;虫生真菌;抗菌【中图分类号】【文献标志码】【文章编号】():,;,;【】,【】;蚱蝉()为蝉科半翅昆虫,以蝉蜕或全体入药,蝉蜕有散热、止咳平喘、止痒、抗过敏、抗肿瘤、治疗疟疾、提高免疫力等功能 。蚱蝉由外源物诱导产生的昆虫抗菌肽类物质分子量小、热稳定、活性强、具有广谱抗菌性,能够抑制、杀死多种细菌、真菌、病毒、癌细胞,可能成为抗生素、抗菌毒素及抗肿瘤药新来源 。虫生真菌()是指侵袭昆虫并在其体内增殖而引起昆虫发病或致死
3、的一类真菌。虫生真菌含有虫草素、多糖类、麦角甾醇、虫草酸、腺苷等多种活性成分,具有降糖、护肾、提高免疫力、抗肿瘤等药用功效 。国内外在抗肿瘤活性方面开展了大量的研究,徐娇 在对蚕蛹蝉花多糖的理化特性及抗氧化、抗肿瘤功能研究中证明一定浓度的滨州医学院学报 年 月第 卷第 期 ,蚱蝉蚕蛹蝉花多糖可抑制周期蛋白 、和周期蛋白依赖性激酶 的表达,并上调抑癌因子 的表达。唐鱼等 在 株虫生真菌抗肿瘤活性的系统性筛选中证实了虫生真菌对 细胞的抑制作用。目前国内对于蚱蝉虫生菌株的研究报道很少,尤其是对于其虫生菌株的作用无具体文献阐述,其体内感染菌的种类尚不可知 。虫生真菌来源广泛,可以通过发酵大量生产或通过
4、改进发酵工艺及菌种选育,挖掘其次级代谢产物,从真菌中研究开发具有高效低毒且资源充分的抗肿瘤药物有很好的前景 。材料与方法 蚱蝉样本及指示菌 年 月采集夏秋之交的蚱蝉虫体,将其保存于无菌密封袋内,带回滨州医学院药学院天然产物与开发研究室,于无菌操作台拍照记录如图 。致病指示菌包括 ,由张光涛教授提供,甘油保存于 冰箱。图 蚱蝉虫体 培养基马铃薯葡萄糖琼脂()固体培养基成分包括 去皮土豆、葡萄糖,琼脂粉。溶菌肉汤培养基()成分包括 胰蛋白胨、酵母浸粉、氯化钠,琼脂粉。酵母膏胨葡萄糖琼脂培养基()成分包括 酵母浸粉、蛋白胨、葡萄糖,琼脂粉。三种培养基均采用 蒸馏水,若需用液体培养基时去除琼脂粉即可。
5、甘油培养基成分包括 甘油、水。仪器手提式高压蒸汽灭菌器(上海申安医疗器械厂,),净化工作台(苏净集团苏州安泰空气技术有限公司,),)全温震荡器(哈尔滨市东联电子技术开发有限公司,),电热恒温培养箱(中国龙口市先科仪器公司,),旋转蒸发仪(上海爱朗仪器有限公司,)。方法 虫生真菌分离纯化在无菌操作台上,将采集感染后的蚱蝉样本依次经 乙醇、蒸馏水重复清洗各三次,用组织切块法把表皮和内脏部分切 的小块,随后均匀插入含有 的氯霉素的 平板上作为母本,放入 的恒温培养箱里培养,待有菌株长出后,挑出分离到新的 培养基,反复转接直至长出单一菌落,则纯化成功虫生真菌,并接种于甘油培养基后 冰箱保存。虫生真菌分
6、子生物学鉴定先将虫生真菌接种到含有 液体培养基的锥形瓶内,在 、条件下摇床震荡培养发酵一周。用无菌纱布过滤收集菌丝体,再用灭菌的滤纸将菌丝体表面的水分吸干,然后采用 法 提取菌株 。结合通用引物 和 进行 扩增,凝胶电泳检测后,切胶纯化目的条带送往山东省济南博尚生物科技有限公司进行测序。虫生抗菌活性测试 同法培养真菌,发酵物过滤后使用甲醇萃取菌丝体,乙酸乙酯萃取水层,减压蒸馏合并两部分得到粗提物,称量后加入 溶解配成 的母液。从 冰箱取出甘油保存的 、,于 固体培养基上活化前三者、培养基活化后者,培养 长出单一菌落。挑取菌落到 的相应液体培养基中,、摇床培养 至液体浑浊。将菌液以 与 的固体培
7、养基混合制作为含受试菌的培养基,把 无菌滤纸片均一贴于受试菌平板,吸取粗提物母液 浸润滤纸表面,恒温箱 培养 后测定抑菌圈的大小,阳性对照为 氯霉素,阴性对照为 。抗菌活性菌株形态学鉴定及系统发育树构建挑取活性菌株单孢接种于 培养基平板中央,将无菌盖玻片 斜插在平板内,恒温培养。后取出长有菌体的盖玻片,依次经 戊二醛、锇酸固定后,使用磷酸缓冲液浸洗 次,通过比例由低到高 、乙醇脱水,最后干燥,将样品取出喷金,在显微镜下观察菌丝和孢子的形态特征。测序得到菌株的 后,矫正序列后于 内选择核酸数据库进行比对,根据序列长度、评分、一致性等评价菌株种属,一致性大于 比对菌株则可确定菌株种属。选择下载一致
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