PDLSCs-Exo对炎性环境中牙周膜干细胞增殖能力及活性氧水平的影响.pdf
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1、北京口腔医学 2024年第32卷第2期 Beijing Journal of Stomatology April 2024,Vol.32,No.286牙周炎是造成成年人牙列缺损和缺失的主要因素,其不仅影响患者的口腔功能,而且与糖尿病、心脑血管疾病等密切相关1。但是目前的治疗策略在炎症控制和修复牙周组织方面效果并不明显2。近年来,应用间充质干细胞治疗全身性疾病取得了一定进展,其在牙周缺损修复方面的应用也成为了目前的研究热点3。牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs)在牙周病的治疗及牙周组织的再生过程中有其独特的优势,但是其在炎性环境中其增殖及成
2、骨分化能力均显著下降。有研究4表明炎性因子脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是造成牙周组织破坏的重要原因,因此,在炎性环境中,如何增强干细胞的修复能力,是利用其进行牙周组织再生修复过程中亟需解决的关键问题。外泌体是由多种细胞分泌的、直径约 30150 nm 的囊泡,其包含多种核酸和蛋白质,与源细胞功能类PDLSCs-Exo 对炎性环境中牙周膜干细胞增殖能力及活性氧水平的影响齐芳芳 郝君玲 李雅 张立亚 李春年 李颖辉【摘要】目的 探讨牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs)来源的外泌体(exosome,Exo)对炎性环境中
3、牙周膜干细胞增殖及活性氧水平的影响。方法 分离培养牙周膜干细胞,提取牙周膜干细胞来源的外泌体,并将其添加至正常及含有 10 g/mL 脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)的牙周膜干细胞培养基中,实验对象分为 PDLSCs 组、PDLSCs+LPS 组、PDLSCs+Exo 组、PDLSCs+LPS+Exo 组,检测各组牙周膜干细胞对外泌体的摄取能力、增殖能力、细胞内活性氧水平及炎性因子水平。结果 在 10 g/mL LPS 刺激下,牙周膜干细胞增殖能力下降。组间对比,PDLSCs+LPS 组较 PDLSCs 组、PDLSCs+Exo 组、PDLSCs+LPS+Exo 组增殖能
4、力显著下降,差异有统计学意义(P 0.05);PDLSCs+LPS+Exo 组增殖能力较 PDLSCs+Exo 组降低,差异有统计学意义(P 0.05);细胞内活性氧及炎性因子对比,PDLSCs+LPS 组较其余三组细胞内活性氧水平增高,差异有统计学意义(P 0.05)。结论 牙周膜干细胞来源的外泌体能够改善 LPS 刺激导致的牙周膜干细胞增殖活性降低,降低胞内活性氧及炎性因子水平,并提高牙周膜干细胞的抗氧化能力。【关键词】牙周膜干细胞;脂多糖;外泌体;增殖;活性氧【中图号】R780.2【文献标识码】A【DOI】10.20049/j.bjkqyx.1006-673X.2024.02.003Ef
5、fect of PDLSCs-Exo on proliferation and reactive oxygen species levels of PDLSCs in inflammatory environment QI Fang-fang,HAO Jun-ling,LI Ya,ZHANG Li-ya,LI Chun-nian,LI Ying-hui.Hospital of Stomatology,Hebei Medical University,Hebei Key Laboratory of Stomatology;Hebei Clinical Research Center for Or
6、al Diseases,Shijiazhuang 050000,China【Abstract】Objective To investigate the effect of exosome(Exo)derived from periodontal ligament stem cells(PDLSCs)on the proliferation and metabolism of PDLSCs in inflammatory environment.Methods The PDLSCs were isolated and cultured,and the exosomes derived from
7、PDLSCs was extracted and added to normal medium and medium containing 10ug/mL lipopolysaccharide(LPS).The subjects were divided into PDLSCs group,PDLSCs+LPS group,PDLSCs+Exo group,PDLSCs+LPS+Exo group,and the capacity of uptake exosomes and proliferation of PDLSCs and the level of intracellular reac
8、tive oxygen species(ROS)in each group were examined.Results The proliferation ability of PDLSCs decreased under the stimulation of 10 g/mL LPS.The proliferation ability of the PDLSCs+LPS group was significantly reduced compared to the PDLSCs group,PDLSCs+Exo group and PDLSCs+LPS+Exo group(P0.05).The
9、 proliferation capacity of PDLSCs+LPS+Exo group was lower than that of PDLSCs+Exo group(P0.05).The PDLSCs+LPS group showed an increase in intracellular reactive oxygen species levels compared to the other three groups(P0.05).Conclusions Exosomes derived from PDLSCs can improve the decreased prolifer
10、ation activity of PDLSCs induced by LPS stimulation,reduce intracellular levels of reactive oxygen species and inflammatory factors and enhance the antioxidant capacity of PDLSCs.【Key words】Periodontal ligament stem cells;Lipopolysaccharide;Exosome;Proliferation;Reactive oxygen species基金项目:河北省医学课题研究
11、计划(20191077);河北省医学课题研究计划(20221446)作者单位:050000 石家庄 河北医科大学口腔医院,河北省口腔医学重点实验室,河北省口腔疾病临床医学研究中心通信作者:李颖辉,E-mail:,电话:0311-86265748北京口腔医学 2024年第32卷第2期 Beijing Journal of Stomatology April 2024,Vol.32,No.287似5,外泌体来源广泛,几乎所有细胞均可产生6,并且有研究表明外泌体在免疫调控、组织损伤修复以及临床疾病检测与诊断等方面发挥重要作用7-9。本研究拟从牙周膜干细胞来源外泌体在炎症微环境中对牙周膜干细胞的调控出
12、发,探讨其对炎性环境中牙周膜干细胞增殖能力及细胞内活性氧水平的影响。材料和方法1.主要试剂与仪器-MEM 培养基、胎牛血清、1000 U/mL 青霉素及链霉素、0.25%胰蛋白酶(Gibco,美国);维生素 C、地塞米松(Sigma,美国);BCA 蛋白检测试剂盒(Invitrogen,美国);小鼠抗人 CD90、小鼠抗人 CD105、小鼠抗人 CD146、小鼠抗人 STRO-1、小鼠抗人 CD34、小鼠抗人 CD45(BD,美国);LPS(索莱宝,北京);活性氧检测试剂盒(碧云天,上海);CCK8 细胞活性检测试剂盒(Biosharp,中国);CD63、CD81 抗体(Abcam,美国);倒
13、置荧光显微镜(Olympus,日本);NTA 纳米颗粒跟踪分析仪(Particle Metrix,德国);多功能酶标仪(BioTek,美国)。2.实验方法原代牙周膜干细胞的分离与培养:于河北医科大学口腔医院颌面外科收集 1214 岁之间因正畸需要拔除的牙体牙周均健康的第一或第二前磨牙,牙齿拔出后立即保存于含 3 倍双抗的-MEM 培养基中,用含 5 倍双抗的 PBS 自根尖向冠部反复冲洗,至冲洗液不再有肉眼可见颗粒,用无菌锋利的 11号手术刀片冠根单向刮取根中 1/3 的牙周膜组织,接种于 T25 培养瓶中,加入完全培养基(含体积分数 15%胎牛血清、100 U/mL 青霉素和 100 g/m
14、L 链霉素、1%谷氨酰胺的-MEM 培养液),在 37、体积分数 5%CO2、饱和湿度条件下培养。原代培养至细胞汇合达 50%80%时,消化、离心、计数并调整细胞密度为 10 个/mL,以 100 L/孔种于96 孔板,倒置显微镜下挑选只有单细胞的孔,标记,补液 100 L,710 d 后收集呈克隆生长的细胞扩增培养,标记为第 1 代细胞。外泌体收集:培养 P3P5 代 PDLSCs,当细胞融合率达到 70%80%时,除去培养基,加入去外泌体血清的-MEM 培养基,连续培养 48 h 后,收集上清液。梯速离心去除细胞及细胞碎片,上清经过 0.22 m 过滤后 30000 r/min 离心 2
15、h,除去上清后获得牙周膜干细胞来源的外泌体,PBS 冲洗后重悬,纳米颗粒跟踪(NTA)检测其粒径与电位,后通过 BCA 蛋白定量试剂盒进行蛋白定量,-80 冰箱保存备用。正常及炎性环境中牙周膜干细胞对外泌体的摄取:将 P3 代牙周膜干细胞以 1105个/孔的密度接种于 6 孔板,对照组为正常牙周膜干细胞,炎性组加入 10 g/mL LPS。两组细胞培养 24 h 后,将PKH26 染色的外泌体以 10 g/mL 的浓度加入孔板,继续培养 12 h 后去除原培养基,PBS 冲洗 2 遍后于倒置荧光显微镜下观察拍照。CCK-8 细胞增殖活性检测:细胞以 103个/孔接种于 96 孔板,根据处理方式
16、分为 4 组:PDLSCs(对照)组,PDLSCs+10 g/mL LPS 组,PDLSCs+10 g/mL外泌体组,PDLSCs+10 g/mL LPS+10 g/mL 外泌体组;细胞贴壁后炎性组加入 LPS,12 h 后外泌体组加入 10 g/mL 外泌体,再过 12 h 后每孔加入 10 L CCK-8 孵育溶液,细胞培养箱内继续孵育 1 h,采用酶标仪在 450 nm 处测定吸光度。细胞活性氧水平检测:细胞以 104个/孔接种于 12 孔板,细胞分组及处理方式同上。加入外泌体后再过 12 h 后采用活性氧试剂盒工作液进行处理,37 细胞培养箱内孵育 30 min,无血清培养基清洗 3
17、遍,倒置荧光显微镜下拍摄,并通过Image-Pro Plus6.0 对图片进行荧光强度定量分析炎性因子检测:细胞以 104个/孔接种于 12 孔板,待细胞贴壁后,相应组加入 LPS 及 10 g/mL外泌体,12 h 后收集各组细胞上清液,按说明书使用各自的特异性 ELISA 试剂盒,测定各组细胞上清液中 TNF-、IL-1、IL-6 浓度。3.统计学分析 使用 SPSS25.0 软件进行统计学分析,所有数据进行正态性检验,组间比较采用单因素方差分析与 LSD 法,P0.05 为差异有显著性意义。结 果1.原代牙周膜干细胞的分离鉴定 采用组织块法获取的人牙周膜干细胞形态呈梭形,与成纤维细胞相似
18、,呈漩涡性生长。流式细胞仪检测间充质干细胞表面标记物 CD90(93.3%)、CD105(89.4%)、CD146(92.6%)、STRO-1(36.6%)阳性表达,造血干细胞标记物CD34(2.03%)、CD45(1.15%)北京口腔医学 2024年第32卷第2期 Beijing Journal of Stomatology April 2024,Vol.32,No.288阴性表达,符合牙周膜干细胞的免疫表型。2.外泌体粒径、电位与蛋白标记物的检测 采用超速离心法提取的牙周膜干细胞外泌体经 NTA 检测显示其平均粒径为 125 nm,电位为(-28.510.68)mV,Western blo
19、t 结果显示其表达外泌体标志性蛋白 CD63、CD81,对照组 PDLSCs无 CD63、CD81 表达,见图 2。3.炎性环境中牙周膜干细胞对外泌体的摄取 牙周膜干细胞培养基内加入外泌体培养 12 h后,倒置荧光显微镜下观察外泌体可被正常和炎性牙周膜干细胞大量摄取,且被摄取的外泌体聚集在细胞核周围,见图 3。4.外泌体对 LPS 刺激下牙周膜干细胞活性的影响 采用 CCK-8 进行细胞增殖活性评估,发现10 g/mL LPS 能够显著抑制细胞增殖。组间对比显示,LPS 组与对照组差异具有明显统计学意义(P 0.05);加入 10 g/mL 外泌体后,正常及炎性牙周膜干细胞的增殖活性明显上升,
20、PDLSCs+Exo 组与PDLSCs+LPS+Exo 组细胞活性与 LPS 组比较有统计学意义(P 0.05),PDLSCs+Exo 组与 PDLSCs+LPS+Exo组比较有统计学意义(P 0.05),PDLSCs+Exo 组、PDLSCs+LPS+Exo 组与对照组比较无统计学差异,提示牙周膜干细胞来源的外泌体可提高正常及炎性环境中牙周膜干细胞增殖活性,见图 4。5.外泌体对 LPS 刺激下牙周膜干细胞活性氧水平的影响 10 g/mL LPS 刺激下,牙周膜干细胞内活性氧水平明显上升,加入 10 g/mL 外泌体后,炎性组细胞内活性氧水平显著降低,组间比较结果为PDLSCs+LPS 组活
21、性氧水平高于其他三组,差异有统计学意义(P 0.05),见图 5。6.外泌体对 LPS 刺激下牙周膜干细胞炎性因子表达水平的影响在10 g/mL LPS刺激下,PDLSCs+LPS组牙周膜干细胞上清液中炎性因子TNF-、IL-1水平明显上升,组间对比高于其他三组,差异有统计学差异(P 0.05);各组IL-6水平组间对比无差异(P 0.05),见图6。讨 论在牙周病的发生发展过程中,图 1 流式细胞术鉴定 PDLSCs图 2 NTA 和 Western blot 检测外泌体粒径、电位检测及蛋白标志物的表达 A:PDLSCs 外泌体粒径分析;B:PDLSCs 外泌体电位检测;C:PDLSCs 外
22、泌体标记物 CD63、CD81 表达情况北京口腔医学 2024年第32卷第2期 Beijing Journal of Stomatology April 2024,Vol.32,No.289革兰氏厌氧菌的有效结构成分内毒素发挥着重要作用,而其细胞壁 LPS 是内毒素的主要成分,对成纤维细胞有明显的毒性作用,是一种公认的可导致牙周组织破坏的毒性因子。虽然目前针对牙周炎治疗的手段多种多样,但无论是局部刮治、牙周手术或是组织工程联合治疗,其疗效均不够理想。如何提高治疗效果,抑制牙槽骨吸收,实现牙周组织的再生一直是困扰研究者和临床医生的问题。牙周膜干细胞存在于牙周组织,其具有增殖速度快、有多向分化能力
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