TILs治疗HCC的研究进展.pdf
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1、中文科技期刊数据库(全文版)医药卫生 收稿日期:2023 年 12 月 21 日 作者简介:韩颢(1984),女,汉族,天津人,硕士研究生,中级职称(助理研究员),研究方向为细胞治疗、免疫细胞。-174-TILs 治疗 HCC 的研究进展 韩 颢1 王欣言1 魏 卿2(通讯作者)1.优赛生命科学发展有限公司,天津 300455 2.博雅干细胞科技有限公司天津分公司,天津 300453 摘要:摘要:肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocyte,TILs)来自于肿瘤组织内部及其周围,是在肿瘤组织中可能起到关键作用的一类淋巴细胞,它们可以在癌症治疗过程中,起到重要作用
2、。近年来,研究人员通过体外扩增 TILs,排除了与抗体相关的免疫细胞缺陷,使其在人类癌症治疗中得到广泛应用。获得的细胞具有强于CIK(cytokine-induced killer cells)细胞 50-100 倍的杀瘤效力。但在原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)的研究中,TILs 的应用相对较少,因此,本文将对 TILs 的研究发展、TILs 的体外制备方法及HCC 研究中涉及到的 TILs 研究和相关结果进行简要概述。通过对这些方面的了解,可以为后续研究提供更多的参考和指导。同时,了解这些对于克服由于癌症的发展和复发造成的治疗难题也是非常必要的。关
3、键词:关键词:原发性肝癌;肿瘤浸润淋巴细胞;过继免疫疗法;抗肿瘤;体外培养 中图分类号:中图分类号:R735 根据世界卫生组织国际癌症研究机构的报告,原发性肝癌(PLC)对人们的生命和健康构成严重威胁,2020 年全球预计新增病例 90.6 万例,死亡 83 万人。在中国,肝癌在死亡率中排名第二,在发病率中排名第五1。PLC 的病理类型主要有三种,包括肝细胞癌(HCC)、肝内胆管癌(CC)和混合型 HCC/CC。其中 HCC占 85%-90%。对于 HCC,目前可用的治疗选择包括肝移植、肿瘤切除、射频消融、分子靶向药物和细胞免疫治疗。然而,HCC 的生存率较低,复发率较高,因为患者初诊时往往已
4、是中期或晚期 HCC,或有微转移肿瘤。终末期 HCC 患者的 1 年中位生存率仅为 11%,而手术切除后的 1 年复发率为 70%,表明这些 HCC 治疗选择是有限的。因此,仍然需要针对 HCC 的新疗法。近几年,随着生物医药领域的迅猛发展,免疫疗法逐渐成为继手术、放疗、化疗后的第四类肿瘤治疗手段。免疫疗法利用我们自身的免疫系统来对抗肿瘤细胞,已经成为肿瘤治疗的热门研究领域。目前,免疫疗法在多种肿瘤类型中显示出了令人鼓舞的治疗效果,包括肺癌、黑色素瘤和淋巴瘤等。这一领域的不断进步为肝细胞癌(HCC)的治疗带来了新的希望。特别是,HCC 患者自身肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)的免疫治疗备受关注。研
5、究表明,HCC 患者体内的 TILs 具有抗肿瘤活性,因此,利用 TILs 进行免疫治疗已成为一种备受期待的治疗策略。具体而言,HCC 浸润淋巴细胞的专属性和抗肿瘤活性表明,该种治疗方法可能在 HCC患者种具有潜在的疗效和应用前景。因此,免疫疗法作为一种新型的治疗手段,为 HCC 患者带来了更为多元化和个体化的治疗选择,为 HCC 的治疗开辟了新的道路。免疫疗法主要包括免疫检查点抑制剂、免疫疫苗和过继免疫治疗疗法等2。根据细胞类型的不同,过继免 疫 疗 法 又 分 为TILs(Tumor-infifiltrating lymphocytes)、CIK(cytokine-induced kill
6、er cell)、DC-CIK(Dendritic cytokine-induced killer cell)、NK(nature killer cell)、CAR-T(Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy)、CART-AFP(Chimeric Antigen Receptor T-Cell Alpha Fetoprotein)、CART-CEA(Chimeric Antigen Receptor T-Cell Carcinoembryonic Antigen)等,同当今热门的 CAR-T 相比(见表 1),TILs 具有天然的肿瘤趋向性
7、和肿瘤浸润能力,且副作用更小,无潜在免疫原性,在实体肿瘤中的应用更具有优势。此外,TILs 治疗还不需要外源基因修饰,因此可以避免许多与基因治疗相关的问题。相比之下,CAR-T 治疗使用修饰过的外周血单个核细胞(PBMCs)活外周血干细胞(HSCs)进行治疗,需要经过全基因组筛选或转移受体设计,而这种方法容易导致免疫原性和细胞毒性,并且很难穿透实体肿瘤。目前 CAR-T 治疗的数据仍然有限,临床安中文科技期刊数据库(全文版)医药卫生-175-全性也需要更多的验证和进一步研究。本文就 TILs 疗法治疗 HCC 的研究进展及 TILs 的制备方式作简单综述,为后续该方向研究提供参考。表 1 TI
8、Ls 同 CAR-T 技术的比较 TILs CAR-T 细胞来源 肿瘤组织 血液 基因修饰 无 有 作用抗原 多靶点 主要靶向一类抗原 治疗肿瘤类型 黑色素瘤、肺癌等实体肿瘤 白血病、淋巴瘤等血液肿瘤 不良反应 暂无免疫原性副反应相关报道 潜在免疫原性:细胞因子风暴 应用类型 自体 自体 1 TILs 的发展简介 肿瘤组织浸润性淋巴细胞(Tumor-infifiltrating lymphocytes,TILs)来自肿瘤内部或肿瘤组织附近,对肿瘤细胞具有特异性识别能力,TILs 以前被认为是肿瘤免疫反应的宿主,在1922 年首次被提到。1986 年 Rosenberg3等人在荷瘤小鼠的肿瘤组织
9、内发现并分离出了 TILs,他们将分离出的细胞用IL-2扩增培养后,再回输到荷瘤小鼠体内,发现肿瘤组织有明显消退,从而证明 TILs 细胞具有抗肿瘤的作用。经过广泛研究,人们发现 TIL 由多种淋巴细胞亚群组成,包括先天性免疫细胞和适应性免疫细胞,如肥大细胞、巨噬细胞、NK 细胞、T 淋巴细胞等。其中 T 淋巴细胞是 HCC 中 TIL 的主要细胞4。此外,Foxp3+、CD3+、CD4+和 CD8+T 淋巴细胞是广泛讨论的 TIL 亚组。到 2021 年 5 月,在 ClinicalTrials上登记备案的 TILs 相关临床试验共 117 例(见图 1),多集中在黑色素瘤上。而治疗肝癌的研
10、究相对较少,仅有 4 例。图 1 截止到 2021 年 5 月 ClinicalTrials 上登记备案的TILs 相关临床试验数量 2 治疗 HCC 的 TILs 制备方法 2.1 肿瘤组织来源的 TILs 一项关于 HCC 过继免疫治疗的期临床研究中,Shan-shan Jiang5等人手术切除肿瘤组织,将组织切成 2-3mm3 小块,使用胶原酶消化,37,气浴恒温震荡 1.5-2 小时。获得的单个细胞悬液使用 100um 细胞滤网过滤,将其添加至淋巴细胞分离液中,密度梯度离心,离心后小心吸取淋巴细胞层,PBS 清洗两次,得到 TILs 细胞,按照 1106个细胞/ml,接种在 12 孔板
11、上,补加 X-VIVO 15 培养基、10%人 AB 血清和 IL-2(2000IU/ml)放入 37、5%CO2培养箱进行培养。培养 10-14 天可将细胞进行冻存或进一步大规模激活扩增。当细胞数量达到 3-6107时,加入 CD3 单抗、4000IU/ml IL-2和辐照后的PBMC 细胞继续培养至治疗水平。参与该研究的 15 名患者(患者特征见表 2)的TILs 细胞在体外培养中成功扩增,并且回输后患者病情均有不同程度缓解,在后续随访的 14 个月内,12名患者已无疾病症状。表 2 一期临床试验中肝癌患者的特征 序号 年龄 性别 ECOG 肝炎病毒感染 肝硬化 既往治疗 01 66 男
12、1 HBV 否 手术 02 37 男 0 HBV 否 手术 03 33 男 0 HBV 是 手术 04 51 男 0 HBV 是 手术 05 59 男 1 HBV 是 手术 06 54 男 0 HBV 是 手术 07 56 男 0 HBV 是 手术 08 56 男 1 HBV 否 手术 09 52 男 0 HBV 否 手术 10 31 男 0 HBV 是 手术 11 40 男 0 HBV 是 手术 12 57 男 0 HBV 否 手术 13 41 女 0 HBV 否 手术 14 35 男 0 HBV 是 手术 15 33 男 0 HBV 是 手术 在另一项 TILs 治疗 HCC 的动物实验中
13、,研究人员Wen-Chao Wang6等人将手术获得的肿瘤组织和正常肝脏组织使用 PBS 和 1640 培养基分别清洗后放入无菌器皿中,将两种组织分别切割成 1mm3 的小块用混合酶(DNA 酶、胶原酶、透明质酸酶)进行消化后过滤,采用淋巴细胞分离液进行密度梯度离心,收集白膜层,台盼蓝染色后计数计活率,将细胞转入 24 孔板中,加入 1640 培养基、10%FBS、6000IU/ml IL-2 进行培养。将扩增后的 TILs 回输到荷瘤小鼠体内,经过 30 天的治疗,肿瘤组织来源的 TILs 细胞使小鼠体内的肿瘤组织明显减小(图 2)。中文科技期刊数据库(全文版)医药卫生-176-注:cont
14、rol:未治疗组;TILs:输注 HCC 患者非瘤肝脏组织来源 TILs 治疗组;TILs:输注 HCC 患者肿瘤组织来源TILs 治疗组。图 2 30 天治疗后荷瘤小鼠体内肿瘤大小 2.2 胸腹水来源的 TILs 一项关于肿瘤患者(原发肿瘤类型见表 3)自体 TILs 治疗恶性胸腔积液的研究中,林菁7等人取肝素抗凝无菌胸水 1000 r/min 离心 10 min,取沉淀的细胞成分以约每毫升(1 5)107 个细胞的浓度悬浮于 Hank s 液,铺垫于淋巴细胞液(Ficoll)上以 1800 r/min 离心 30 min,收集界面上的淋巴细胞。Hank s 液洗涤 2 次后,用 RPMI
15、1640 完全培养液调整细胞浓度为 1106/ml,其中 IL-2 1000 U/ml,10%人 AB 血清,置 37,5%CO2培养箱中培养 2 周左右。根据扩增及代谢情况按需换液。收集 TILs 细胞。体外扩增收获的 TILs 细胞配合 40 万 IU 的 IL-2 经胸腔回输至患者体内,回输前胸穿尽可能将胸腔积液抽干净,反复回输 2-3 次直至胸腔积液完全消失或明显减少。经过治疗,107 例患者中,TILs/lL-2 治疗后有73例完全缓解(70.2%),23 例部分缓解(22.1%),7 例无效(6.7%),总有效率(CR+PR)92.3%。表 3 107 例恶性胸腔积液患者的原发肿瘤
16、类型(n)原发肿瘤 病例数 双侧胸腔积液 单侧胸腔积液 肺癌 74 9 65 乳腺癌 2 2 0 肝癌 4 0 4 卵巢癌 9 3 6 胃癌 2 0 2 大肠癌 3 1 2 鼻咽癌 2 2 0 宫颈癌 8 2 6 其他 3 0 3 合计 107 19 88 一项关于晚期肝癌腹水病人的 TILs 治疗中,研究者对 5 例肝癌腹水患者腹腔注射 IL-2 和 TNF 每周 2次,共 6 次,完成后第 2 天抽吸腹水,常规分离淋巴细胞进行培养,7 天后静脉回输,4 周后评价疗效,发现腹水完全缓解 1 例,部分缓解 2 例,微小缓解 1 例;肝内病灶部分缓解 2 例,微小缓解 1 例;肝门淋巴结肿大部分
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