动物组织基因组DNA的提取-PPT.ppt

实验三动物组织基因组DNA的提取实验目的实验目的1.实验原理（核酸分离纯化）实验原理（核酸分离纯化）2.实验仪器、试剂和耗材实验仪器、试剂和耗材3.实验步骤实验步骤4.实验结果与讨论实验结果与讨论5.动物组织基因组DNA的提取一、实验目的n从从小小鼠鼠尾尾巴巴中中提提取取纯纯的的基基因因组组DNA;n掌掌握握基基因因组组DNA抽抽提提的的办办法法，理解核酸分离纯化的基本原理；理解核酸分离纯化的基本原理；二、实验原理nDNA：主主要要存存在在于于细细胞胞核核的的染染色色体体中中。核核外外也也有有少少量量DNA，如如线线粒粒体体DNA（mtDNA）、叶叶绿体绿体DNA（cpDNA），质粒），质粒DNA。nRNA：存存在在于于细细胞胞质质中中，如如mRNA，rRNA，tRNA等。等。1 1、核酸的分类、核酸的分类二、实验原理n分离纯化核酸总的原则：分离纯化核酸总的原则：应保证核酸一级结构的完整性；应保证核酸一级结构的完整性；排除其它分子的污染；排除其它分子的污染；n核酸纯化应达到的要求：核酸纯化应达到的要求：核核酸酸样样品品中中不不应应存存在在对对酶酶有有抑抑制制作作用用的的有有机机溶剂和过高浓度的金属离子；溶剂和过高浓度的金属离子；其它生物大分子的污染应降到最低程度；其它生物大分子的污染应降到最低程度；排除其它核酸分子的污染；排除其它核酸分子的污染；2 2、核酸制备的一般原则、核酸制备的一般原则二、实验原理n核酸制备时应注意的事项：核酸制备时应注意的事项：尽量简化操作步骤，缩短提取过程；尽量简化操作步骤，缩短提取过程；减少化学因素对核酸的讲解；减少化学因素对核酸的讲解；减减少少物物理理因因素素的的核核酸酸的的讲讲解解：机机械械剪剪切切力力和和高温；高温；防止核酸的生物讲解；防止核酸的生物讲解；2 2、核酸制备的一般原则、核酸制备的一般原则二、实验原理降降低低温温度度，改改变变pH值值，及及盐盐的的浓浓度度，都都利利于于对对核核酸酸酶酶活活性性的的抑抑制制，但但均均不不如如用用核核酸酸酶酶抑抑制制剂剂更更有利，几个条件并用更好。有利，几个条件并用更好。DNA，抑抑制制Dnase活活力力很很容容易易，但但防防止止机机械械拉拉力张力更重要；力张力更重要；RNA，因因分分子子较较小小，不不易易被被机机械械张张力力拉拉断断，但但抑抑制制Rnase活活力力较较难难，故故在在RNA提提取取中中设设法法抑抑制制Rnase更重要。更重要。3 3、核酸酶的抑制和抑制剂、核酸酶的抑制和抑制剂二、实验原理nDnase抑制：抑制：加加入入少少量量金金属属离离子子螯螯合合剂剂，如如0.01 mol/L EDTA或柠檬酸钠，或柠檬酸钠，Dnase基本可以全部失活；基本可以全部失活；去去垢垢剂剂、蛋蛋白白变变性性剂剂及及Dnase抑抑制制剂剂也也可可使使Dnase失活；失活；3 3、核酸酶的抑制和抑制剂、核酸酶的抑制和抑制剂二、实验原理nRNase抑制：抑制：操作要带手套；操作要带手套；所有器皿要严格消毒；所有器皿要严格消毒；试剂处理；试剂处理；低温操作；低温操作；在分离过程中要加入一定的在分离过程中要加入一定的Rnase抑制剂抑制剂3 3、核酸酶的抑制和抑制剂、核酸酶的抑制和抑制剂二、实验原理4 4、核酸制备中常用的去垢剂、核酸制备中常用的去垢剂核核酸酸本本身身带带负负电电荷荷，结结合合带带正正电电荷荷的的蛋蛋白白质质，用用于于核核酸酸提提取取的的去去垢垢剂剂一一般般都都是是阴阴离离子子去去垢垢剂剂，去垢剂的作用：去垢剂的作用：溶解膜蛋白及脂肪，使细胞膜破裂；溶解膜蛋白及脂肪，使细胞膜破裂；溶溶解解核核糖糖体体上上面面的的蛋蛋白白，使使其其解解聚聚，将将核核酸酸释放出来；释放出来；对对Rnase和和Dnase有一定的抑制作用；有一定的抑制作用；如如:SDS，脱脱氧氧胆胆酸酸钠钠，4-氨氨基基水水杨杨酸酸钠钠，萘萘-1，5-二磺酸钠等二磺酸钠等二、实验原理5 5、核酸制备中常用的蛋白质变性剂、核酸制备中常用的蛋白质变性剂蛋白质变性剂的作用：蛋白质变性剂的作用：使使蛋蛋白白质质变变性性、沉沉淀淀，从从核核酸酸提提取取液液中中分分离离除去，以防造成蛋白质污染；除去，以防造成蛋白质污染；使使蛋蛋白白质质变变性性，故故可可使使核核糖糖体体解解聚聚释释放放出出核核酸；酸；某某些些蛋蛋白白质质变变性性剂剂也也可可抑抑制制Rnase活活性性和和破破裂细胞的作用；裂细胞的作用；如：苯酚、氯仿、盐酸胍、如：苯酚、氯仿、盐酸胍、DEPC二、实验原理6 6、核酸制备的步骤、核酸制备的步骤破碎细胞破碎细胞提取提取纯化纯化二、实验原理6 6、核酸制备的步骤、核酸制备的步骤破碎细胞破碎细胞 微生物：溶酶菌、微生物：溶酶菌、SDS裂解；裂解；高等植物：捣碎器破碎、液氮研磨。高等植物：捣碎器破碎、液氮研磨。酶法酶法蛋白酶、胰蛋白酶；蛋白酶、胰蛋白酶；冰冰冻冻法法 反反复复冻冻融融或或液液氮氮冻冻后后组织捣碎；组织捣碎；动物：液氮处理后用匀浆器破碎；动物：液氮处理后用匀浆器破碎；以上处理时均要加入核酸酶抑制剂。以上处理时均要加入核酸酶抑制剂。二、实验原理6 6、核酸制备的步骤、核酸制备的步骤 首首先先使使脱脱氧氧核核糖糖核核蛋蛋白白、核核糖糖体体、病毒的核蛋白与其它成分分离；病毒的核蛋白与其它成分分离；使核酸与蛋白质分离；使核酸与蛋白质分离；除去脂类；除去脂类；多糖的除去；多糖的除去；破碎细胞破碎细胞提取提取二、实验原理6 6、核酸制备的步骤、核酸制备的步骤根根据据所所需需核核酸酸的的性性质质和和特特点点除除去去其其它它核核酸酸污污染染，并并除除去去其其它它提提取取过过程程中中的的一一系系列列试试剂剂（盐盐、有有机机溶溶剂剂等等）杂杂质质，最后得到均一的核酸样品。最后得到均一的核酸样品。破碎细胞破碎细胞提取提取纯化纯化二、实验原理7 7、核酸样品的保存、核酸样品的保存核酸保存的主要条件是温度和介质核酸保存的主要条件是温度和介质温度：温度：4 最佳最简单；最佳最简单；-70长期保存的良好温度；长期保存的良好温度；-20；保存介质：保存介质：TE缓冲液（最常用）缓冲液（最常用）10mmol/L Tris-HCl pH 8.0 1mmol/L EDTA pH 8.0三、实验试剂、仪器和耗材材料：小鼠尾巴材料：小鼠尾巴仪器：离心机、各种规格移液器、无仪器：离心机、各种规格移液器、无菌移液器吸头、分光光度计菌移液器吸头、分光光度计试剂：试剂：组织基因组组织基因组DNA提取试剂盒提取试剂盒 无水乙醇无水乙醇四、实验步骤 在液氮中将组织块研磨粉碎；在液氮中将组织块研磨粉碎；取取不不多多于于50 mg磨磨碎碎的的组组织织，放放入入1.5或或2.0 ml离离心心管中。注意：样本的磨碎程度将影响裂解效果。管中。注意：样本的磨碎程度将影响裂解效果。加加入入600ul的的FL Buffer和和10ul PK solution，混混合合均匀。注意混合充分将有助于裂解。均匀。注意混合充分将有助于裂解。于于56温温浴浴15min（如如果果组组织织较较难难裂裂解解完完全全，可可以以适适当当延延长长温温浴浴时时间间，甚甚至至过过夜夜）。然然后后14000g离离心心3min。取取500ul上清液，至新的上清液，至新的2.0ml离心管中。离心管中。四、实验步骤 加加入入700ul binding buffer和和300ul无无水水乙乙醇醇，颠颠倒倒混匀；混匀；将将混混合合液液转转移移至至Spin Colomn。于于10000g离离心心1min，并并弃弃去去接接液液管管中中的的液液体体。由由于于混混合合液液体体积积大大于于750ul，请分两次离心过柱。，请分两次离心过柱。向向Spin colomn中中加加入入500ul的的PW Buffer。于于10000g离心离心30s，并弃去接液管中液体。，并弃去接液管中液体。向向Spin colomn中中加加入入600ul的的Wash Bufer。于于10000g离心离心30s，并弃去接液管中液体。，并弃去接液管中液体。重复实验步骤重复实验步骤9。四、实验步骤11 再再次次将将Spin Colomn于于10000g离离心心1min，并并将将Spin Colomn转移至一个新的转移至一个新的1.5ml离心管；离心管；12 向向Spin colomn中中加加入入100ul-200ul Elution Buffer,并于室温放置并于室温放置1min。13 10000g离离心心1min，并并弃弃去去Spin Colomn,1.5 ml离离心管中液体含有心管中液体含有DNA。五、实验结果检测检测DNA的浓度和质量：的浓度和质量：取取出出一一部部分分的的DNA，用用elution buffer稀稀释释到到一一定定的的倍倍数数，用用紫紫外外分分光光光光度度计计分分别别测测定定OD260，OD280，OD320.DNA浓度浓度:（ug/ml）=50 x OD260 x 稀释倍数稀释倍数DNA质量质量:2.0 OD260-320/OD280-320 1.7注意：注意：1.0 OD260 0.1