1018四湖总干渠壬基酚和双酚A对餐繁殖的影响1.doc
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1、四湖总干渠环境雌激素不同浓度江段繁殖生物学比较研究郭嫦娟1,2,廖涛3,柳明1,谢松光1,4(1.中国科学院水生生物研究所,中国科学院水生生物多样性与保护重点实验室,武汉430072;2.中国科学院研究生院,北京 100049;3. 湖北省农业科学院,武汉430062;中国科学院水生生物研究所淮安研究中心,淮安223002)摘 要:本文选取湖北四湖总干渠污染水平不同的3个江段(A、B、C),A离源头较近,B位于一农药厂排污口下方,C位于一城镇居民排污口下方,比较繁殖群体的生物学特征。A江段水体中未检测出环境雌激素,而B、C两江段主要含有壬基酚和双酚A,两种污染物总浓度在20g/L左右。与A江段
2、相比,B、C江段繁殖群体中雌性个体的比例明显较高,卵粒较小;雄性个体精巢中空增大,结缔组织坏死或断裂,精原细胞和精子细胞密度低;肝体指数增大、肝组织出现大量空泡,肝细胞密度降低、细胞核不明显等特点。壬基酚和双酚A已被证明具有显著的雌激素活性和生殖毒性。因此,B、C江段壬基酚和双酚A环境雌激素浓度较高可能是导致繁殖群体生物学特征改变的重要原因。关键词: 环境雌激素;壬基酚;双酚A; (Hemiculter leucisculus);繁殖生物学特征Abstract:Recently, a lot of data from laboratory experiments have supported
3、that nonylphenol and bisphenol A in the aquatic environment can impact the reproductive health of various fish species, but the evidence of field studies is scarce. In this paper, the study location is the Main Irrigation Channel of the Four Lake area of Hubei province, we choose three different pol
4、lution level sections of this river as the sample locations, use GC-MS to detect the level of nonylphenol and bisphenol A in the water, and compare sex ratio, hepatosomatic index(HSI), egg diameter, liver and testis histology of sawbelly. No target chemicals was detected in location A, but the water
5、 both in location A and B contained nonylphenol and bisphenol A on some states. Sawbelly in B and C have higher female percentage and HSI than A, but smaller egg diameter than A, at the same time, differences in liver and testis histology structure between these three locations are very apparent.Key
6、 words:endocrine disrupting chemicals, nonylphenol, bisphenol A, sawbelly (Hemiculter leucisculus), Reproductive characteristics环境内分泌干扰物(Environmental endocrine disrupting chemicals, EDCs)是指可干扰生物体内保持自身平衡、调节发育过程中的内源激素的合成、分泌、运输、结合和代谢等过程的外源性化学物质1,又称环境雌激素。我国主要河流水系及沿海地区水体均不同程度受到环境雌激素的污染,多氯联苯(PCBs)、壬基酚、双酚
7、A、邻苯二甲酸酯类等有机化工原料内分泌干扰物一般在南方水体检出率较高,有机氯农药和生活用水排放是这些环境雌激素的主要来源2。环境雌激素对生态环境和人类健康的影响已受到社会的广泛关注。大量实验室毒性实验证明,环境雌激素影响鱼类的生长和繁殖3-5,这种个体水平的影响可能进一步影响鱼类的种群动态。然而有关自然水体中环境雌激素的生物学效应研究还很少。(Hemiculter Leucisculus)隶属于鲤形目(Cyprinidae)、鲤科(Cyprinidae)、属,生活于水体中上层的小型鱼类,在我国分布广泛6。分批产卵,繁殖季节为4-8月,5-6月为盛季。本文选择湖北省境内四湖总干渠,比较环境内分泌
8、干扰物不同污染程度江段的生长和繁殖,以期为评价环境内分泌干扰物对鱼类的影响效应提供自然水体的证据,并为筛选内分泌干扰物的生物标志物提供依据。1 研究地点图1 湖北四湖总干渠,示采样点位置A、B、C ()Fig. 1 The main Irrigation Channel of the Four Lake area in Hubei Province, China, showing the sampling locations A, B, and C ()四湖总干渠源于湖北荆州郊外,经潜江、监利、洪湖至新滩口汇入长江,全长100多公里7。沿途城镇生活污水、工业废水和农田用水排入总干渠8。总干渠中
9、没有鱼类放养和渔业捕捞。采样在A、B、C三个河段进行。其中A段(302149N/1123012E)离源头较近,水质良好;B段(301109N/1123609E)位于一个农药厂排污口下方;C段(300324N/1125421E)位于某城镇排污口下方。2 材料与方法2.1 主要仪器与试剂波恩氏液(苦味酸饱和水溶液:甲醛:冰醋酸为15:5:1);肝素钠溶液(用无菌水配成1mg/mL的浓度,4保存);5%甲醛溶液,无水乙醇,浓H2SO4 (上海国药);雌激素标准品(Sigma公司);色谱分析中的乙酸乙酯、甲醛、正己烷为农残级,乙腈为色谱纯电子天平 (0.001g)(SHIMADZU- BL-320H)
10、;GC-MS(Agilent);HBL柱(Waters);光学显微镜(OLYMPUS BX51);解剖镜(OLYMPUS-SZX16);轮转式切片机(LEICA -RM2235) 2.2样品采集与处理采样于2009年6月19日和20日进行,采用流刺网(长:17m,宽1m,网目:2.0cm)采集繁殖群体,每个采样点采集30尾以上。样品采集后立即置于冰块中保存,带回实验室后测定标准体长(standard length, SL, 0.1mm)、称体重(body weight, BW, 0.01g);将腹部剖开,观察性腺,确定性别;取出肝脏、称重(liver weight,LW,0.001g),肝体指
11、数(HSI)采用以下公式计算:HSI=LW/BW100%。取部分肝脏和精巢组织用波恩氏液固定12-24 h后,转入70%乙醇溶液中保存,用于组织切片和观察。切片时先后采用乙醇梯度浓度脱水,二甲苯透明,石蜡包埋,切片,烘片,二甲苯脱蜡、系列乙醇复水,苏木精伊红染色,乙醇脱水、二甲苯透明,中性树胶封片,在显微镜下观察并拍照;选择性腺发育至IV期或V的雌鱼,分离部分卵巢,称重后固定于5%的福尔马林溶液中,在解剖镜下测定卵径。鱼类采集同时用采水器采集表层水样3L,现场用浓硫酸固定,采用0.45m滤膜过滤,用浓硫酸将pH值调为3左右,保存于4,48小时内进行环境雌激素分析。测定时采用固相萃取方法对样品进
12、行浓缩分离,采用气相色谱与质谱联用GCMS的方法测定水样中环境雌激素浓度9。2.3 数据处理采用嵌套方差分析(Nested ANOVA)检验不同样点间卵径差异显著性。采用单因子方差分析(One-way ANOVA)检验不同样点、性别的HSI的差异显著性。显著性检验的显著水平为P0.05。统计分析采用 STATISTICA 6.0 进行。3 结果3.1 不同江段内分泌干扰物浓度A河段水样中没有检测出环境雌激素, B、C两河段水样中均检测出壬基酚和双酚A两种环境雌激素,B、C两河段间两种污染物浓度均无显著性差异(表1)。3.2繁殖生物学指标A、B、C三个样点分布采集繁殖群体个体51尾、41尾和39
13、尾,其中雌鱼所占比例分别为39%、58%和61%。污染点B、C的雌鱼所占比例高于对照点A(表1)。样点对卵径存在显著的影响(Nested ANOVA, P0.05),多重比较表明A样点卵径平均值显著小于B、C样点,B、C样点间卵径平均值差异不显著(表1)。表1湖北四湖总干渠不同采样江段(A、B、C)环境雌激素浓度和繁殖群体的生物学特征。采样江段位置见图1.Table 1 The concentration of envirnonmetal endron in the water and the reproductive biology characteristics of Hemiculter
14、 leucisculus at the three sampling sections (A, B, and C) in the Main Irrigation Channel of the Four Lake area in Hubei Province. The locations of the sampling locations are showed in Figure 1.ABC环境雌激素浓度双酚A-7.301.913.151.11壬基酚-12.843.4918.122.84繁殖群体生物学指标雌性个体百分比(%)38.05861卵径(mm)0.670.0837a0.50790.052
15、1b0.51000.048 b肝体指数(雌)1.44150.9447a2.56680.5707 b2.70380.4399 b肝体指数(雄)0.95770.5490a1.40180.5849 b1.68500.4838 b注:同一行中参数字母相同则无显著性差异(P0.05),反之,则有显著性差异(P0.05)Note: Means in a row with different superscripts are significantly different from each other (P0.05).3.3肝体指数和肝脏组织学采样点和性比对的HSI均存在显著差异(two-way ANOV
16、A)。A样点雌性和雄性个体的HSI均显著低于B、C样点(P0.05);三样点中雌性个体的肝体指数均显著高于雄性个体(P0.05)(表1)。不同采样点肝脏切片的存在明显的差异。对照样点A的肝细胞排列紧密,细胞核清晰,细胞质丰富(图2-A);但是B和C采样点的肝组织出现大量空泡、孔洞,肝细胞密度降低,细胞核不明显。 图2 四湖总干渠不同江段肝脏组织切片显微照片。图中A、B、C分别代表从A、B、C江段采集的个体。示B、C江段肝脏组织空泡()Fig. 2 The liver histological pictures of Hemiculter leucisculus from different s
17、ections of the Main Irrigation Channel of the Four Lake Area in Hubei Province. Pictures A, B, and C represent the fish individuals from the sampling locations A, B, and C respectively. Liver vacuole is located in pictures A and B (). 3.4 精巢切片不同采样河段精巢组织切片存在明显差异(图3)。 A样点的精巢发育良好,生精小叶直径很大,排列紧密,小叶间结缔组织丰
18、富,各个时期的细胞染色质丰富,嗜碱性强,被染成深色(图3-A1, -A2); B、C两样点精巢中空显著较大,结缔组织坏死或断裂,精原细胞和精子细胞密度都明显下降,表明生精过程受阻,精巢的发育受到抑制(图3-B1, -B2, -C1, -C2)。 图3 四湖总干渠不同江段精巢组织切片。图A1、B1、C1和A2、B2、C2分别为A、B、C江段Can精巢组织在不同显微放大倍数下的照片。示精巢组织间隙()Figure 3. The testis histological pictures of Hemiculter leucisculus from different sections of the
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