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上海市第六人民医院基金申请书项目名称 控制性促排卵过程中的血清代谢组学与性激素相关性分析依托科室 生殖医学中心 申 请 人 王利红 职 称 副主任医师 起止年限 2016年3月2017年6月 申报日期:2016年1月10日上海市第六人民医院院级课题研究基金一、申请人信息姓 名王利红性 别女出生日期1976。3。3最高学历博士研究生最高学位博士毕业院校山东大学科 室生殖医学中心职 称副主任医师研究领域生殖内分泌与代谢办公电话24056306移动电话[phone]电子邮件lihongwang1976126。com二、项目摘要（限400字）摘 要控制性促排卵技术的使用大大推动了IVF-ET技术的快速普及，除B超与性激素检测外，COS的效果仍缺乏有效评价手段，建立一种新型高效的COS促排效果的早期评价技术具有十分重要的临床意义.代谢组学是继基因组学和蛋白质组学后又一新兴的生物学研究技术，通过比较样本间代谢物水平的变化,可筛选出与疾病发生、发展密切相关的生物标志物。目前，该方法已应用于诊断的疾病、药效的判断以及疾病转归，但在生殖技术领域中的研究仅局限于实验室与男科方面，女性不孕研究发展缓慢，而与ART控制性促排卵技术相关的研究处于空白。本课题选取IVF控制性促排卵周期中获得的血清，利用GCMS与LC-MS技术及有关生物信息学的方法,研究在窦卵泡发育过程中,控制性促排卵过程中四个关键点（启动日、Gn56天、HCG日、取卵日）的血清代谢物种类及浓度变化，进一步分这些代谢产物与性激素变化的相关性。为临床辅助生殖技术中的促排卵方案的改进提供一些创新性的客观指标提供理论基础。关键词（用分号分开，最多5个）控制性促排卵,代谢组学,性激素6经费申请表支 出 科 目金 额(元）计 算 根 据 及 理 由设备费无（如果填写，则需要说明理由）材料费无(如果填写，则需要说明理由）测试化验加工费3。6万元转化医学中心检测费300元/样,共计120个样本，合计3。6万元出版/文献/信息传播/知识产权事务费无（如果填写,则需要说明理由）差旅费无（如果填写，则需要说明理由）其他无(如果填写，则需要说明理由）合 计3。6万元 报告正文一、 立项依据与研究内容（一） 项目立项依据进入二十一世纪，不孕症已经成影响人类身心健康的重大疾病之一，10的发病率让成年上万的家庭长期保守无法生育的困扰.控制性促排卵技术(controlled ovarian stimulation，COS）的使用大大推动了IVF-ET技术的快速普及，显著提高了ART助孕患者的成功率。然而目前，判断COS的促排效果通常采用性激素与B超监测卵泡大小,前者主观性太强,性激素分泌易受多种因素的干扰，有时不能准确反映卵子发育情况,如拮抗剂的使用,反应卵泡生长的雌激素水平通常与获卵数更相关，而与卵子的质量没有相关性1。因此,临床上我们仍缺乏能够有效预测COS技术对卵子发育影响的监测指标,也就无法早期预测COS中发生的不可逆的卵子损伤，从而失去改善的机会.因此,建立一种新型高效的COS促排效果的早期评价技术，对于改善COS中的卵子质量,提高IVF的促排卵效果具有十分重要的意义。代谢组学是继基因组学和蛋白质组学后又一新兴的生物学研究技术。有Nicholson于1999年最早提出2，该技术以组群特征分析为基础，以分子量1000Da小分子代谢物（包括各种氨基酸、部分多肽、脂肪酸、核苷酸等）为研究对象，以高通量分离、检测和处理数据为手段,通过比较样本间代谢物水平的变化,鉴定生物体在不同生理状态下的特征代谢物，筛选出与疾病发生、发展密切相关的生物标志物。该方法具有效率高、灵敏度高和特异性高的特点，目前已开始应用于诊断的疾病、药效的判断以及疾病转归,在探索疾病的发生机理，在疾病诊断领域有着广阔的应用前景。自代谢组学的方法应用于生殖医学领域以来，在卵泡液代谢组学、胚胎代谢组学、精浆代谢组学等领域发展迅速，2007年2015年的相关研究文献详见表一。汇总分析后，发现代谢组学在生殖医学领域中的应用仍处于起步阶段,研究仅局限于实验室与男科方面，女性不孕症的血清代谢组学研究报道很少，仅见对多囊卵巢综合征，子宫内膜异位症的血清代谢标志物的研究表一：第四部分，而在ART控制性促排卵技术相关的研究处于空白.在少数不孕及相关疾病的血清代谢组学的研究当中,有关PCOS的分析显示多为脂质代谢途径、糖代谢途径上的中间或终末代谢产物分泌异常,如2015年杨兆鹏等3采用基于反向的液相色谱与串联四级杆飞行时间质谱联用技术（RPLC/QTOFMS)液相色谱质谱联用技术，对74例PCOS患者进行了脂质组学的分析,定性鉴别出15类314中的脂质化合物，结果发现多囊卵巢综合征患者与正常人相比，不饱和脂肪酸、部分鞘磷脂、甘油二酯、甘油三酯呈上调趋势； 部分磷脂酰胆碱、溶血性磷脂酰胆碱、溶血性磷脂酰乙醇胺呈下调趋势。而肥胖多囊卵巢综合征患者与非肥胖多囊卵巢综合征患者相比，不饱和脂肪酸、鞘磷脂、甘油二酯、甘油三酯上调更为明显; 溶血性磷脂酰胆碱、部分磷脂酰胆碱下调更为明显.2015年，乔杰等4在Free Radic Biol Med新发表的有关PCOS卵泡液代谢组学的研究，结果表明:无肥胖的高雄激素血证中间代谢产物变化，卵丘细胞中的氧化还原电位失平衡导致线粒体功能障碍，卵泡液中间代谢产物提供了卵丘细胞线粒体与PCOS卵巢局部代谢特征的联系.代谢组学在子宫内膜异位症疾病诊断中的应用价值近年来受到关注。2015年 Vincente等用5NMR技术检测了45例的患者晨尿中的代谢产物,相比对照组，发现更低浓度的肌酐，牛磺酸，缬氨酸，赖氨酸等,而这些因子大多数是参与炎症与氧化应激过程的物质。2015年 Jana等6应用NMR技术发现在子宫内膜异位症患者的血清当中,与糖代谢增加一致的是，柠檬酸和琥珀酸在EMT的患者中增加。高水平的氧化应激产物，脂质过氧化反应以及氧化蛋白产物，降低了患者的抗氧化能力,超氧化物歧化酶，过氧化氢酶，谷胱甘肽也同时降低.增加的糖代谢以及线粒体呼吸系统缺陷提供了过多的活性氧,可能是导致EMT产生的主要原因。Cordeiro等7从腹腔镜确诊的子宫内膜异位症的IVF患者卵泡液中进行脂质代谢组学的研究后发现,无EMT组中存在着磷脂酰甘油磷酸胆碱，磷脂酰丝氨酸,phosphatidylnositol二磷酸的分泌.在子宫內异症组，鞘磷脂和磷脂酰胆碱更丰富。据我们查询的文献，国内外均未见有关体外受精胚胎移植技术常用COS技术中血清代谢组学的研究。促排卵过程中，性激素的改变反应了机体的应答效应,其相关代谢产物必然发生不同程度的变化,这些代谢产物的变化是否存在可探寻的规律，可否反应卵子的质量,对客观评价COS技术具有重要的临床应用价值，亟待研究。本课题选取IVF控制性促排卵周期中获得的血清,利用GC-MS与LCMS技术及有关生物信息学的方法,研究在窦卵泡发育过程中,控制性促排卵过程中四个关键点(启动日、Gn56天、HCG日、取卵日)的血清代谢物种类及浓度变化，进一步分这些代谢产物与性激素变化的相关性,为临床辅助生殖技术中的促排卵方案的改进提供一些创新性的客观评价指标。参考文献：1、梁晓燕，马文红，杨刚.控制性卵巢刺激中HCG注射后雌二醇浓度下降的原因分析.中山大学学报(医学科学版），2010，31（4)：530-532。2、刘贤青,罗杰.植物代谢组学技术研究进展.科技导报，2015，33 (16）: 33-38。3、杨兆鹏，徐芳，赵欣捷，等.基于液相色谱质谱联用技术的多囊卵巢综合征患者血清脂质组学分析。分析化学，2015，43（10）：1445-1451.4、Zhao H， Zhao Y， Li T， Qiao J，et a. Metabolism alteration in follicular niche： The nexus among intermediary metabolism, mitochondrial function， and classic polycystic ovary syndrome。 Free Radic Biol Med。 2015，86：295307。 。5、Vicente-Muoz S(1)， Morcillo I（2）, PuchadesCarrasco L Nuclear magnetic resonance metabolomic profiling of urine provides a noninvasive alternative to the identification of biomarkers associated with endometriosis。Fertil Steril. 2015，Epub ahead of print6、Jana SK ， Dutta M ， Joshi M ， Srivastava S ， Chakravarty B ， Chaudhury K . 1H NMR based targeted metabolite profiling for understanding the complex relationship connecting oxidative stress with endometriosis. Biomed Res Int 2013； 329058。 7、Cordeiro FB(1）， Cataldi TR(1）， Perkel KJ(2）, Lipidomics analysis of follicular fluid by ESIMS reveals potential biomarkers for ovarian endometriosis。J Assist Reprod Genet。 2015 Oct 26. Epub ahead of print（二） 项目的研究内容、研究目标，以及拟解决的关键科学问题研究目的：本研究拟从代谢组学的角度出发，以人体外受精促排卵周期为实验模型，研究机体在促排卵过程中代谢状况的变化,以及与性激素九项的相关性，寻找卵泡发育过程中评价COS效果的新的代谢标记物,旨在探讨影响机体促排中的代谢途径,阐明促卵过程引起卵子损伤的机理，为今后有针对性地采取措施避免卵子损伤提供理论基础。具体包括：1、利用GC-MS/LC-MS技术，建立COS四个关键时间点上的血清代谢物图谱，对差异代谢物进行生物信息学分析,初步筛选COS中的促进卵泡生长发育的标志性代谢物。2、观察IVF促排过程中几个关键时间点的血清代谢物变化与性激素变化的关系,为进一步多角度优化促排卵过程以获得更优质卵子提供一个新的思路。（三） 拟采用的研究方案及可行性分析研究方案：1、一般资料：IVF促排卵周期选择2016年82017年1月因单纯输卵管因素或男性因素在六院生殖中心行IVF/ICSI治疗的女性，共30例,年龄在2538岁，BMI位于1924kg/m2，OGTT、甲功3项正常.采用拮抗剂案促排卵。排除标准：PCOS,EMT患者.2、血液样品的采集与处理血液样品:选择启动日、促排56日、HCG扳机日、取卵日的四个点，分别用促凝剂采血管从患者静脉采集血液5ml，静置30min后离心（4000rpm离心10min，湘仪离心机厂，）分离血清，移入1。5ml的EP管中，80度保存,待测。3、血液性激素指标检测和数据分析卵泡刺激素(FSH）、黄体生成素（LH）、雌激素(E2）、孕激素（P）、垂体泌乳素(PRL）、睾酮（T)、性激素结合球蛋白（SHBG）、游离睾酮(FT）、绒毛膜促性腺激素(HCG)等指标（全自动荧光生化分析仪,美国ACCESS 2）(表一）。4、液相色谱/气谱联用质谱(LCMS/GCMS)分析技术样本分析前使血清在室温解冻，然后严格按照超气谱或液相色谱联用质谱联用仪的要求对样品衍生处理,进行代谢全谱的测定。全谱的检测代谢物包括氨基酸，有机酸，脂肪酸，胺类等.5、 统计学处理性激素各指标数据用meanSD表示，用Graphpad prism5。0统计软件进行分析。组间差异比较采用单因素方差分析(Oneway ANOVA)，当有显著差异时（P0。05)，再采用Turkey法进行多重比较，以P0。05为显著准，P0。01为差异极显著.对采集到的代谢物数据，运用数据库对检测到的代谢物变量进行化合物种类鉴别,再用模式识别方法中的偏最小判别二乘分析法(partia1 1east squares discriminant analysis,PLS-DA) 筛选生物标记物。表1 人血清性激素指标项目启动日Gn56天HCG日取卵日P值FSHLHE2PTSHBGHCG血清代谢组学分析血清性激素检测LC/GC-MS化学发光IVF控制性促排卵（30例）启动日Gn56HCG日取卵日技术路线：本项目的特色与创新之处1、 检测COS过程中代谢组学的图谱变化，从转化医学的角度寻找除B超或性激素检测以外的评价COS效果新型生物标记物。2、 寻找控制性促排卵过程中代谢组学与女性性激素之间的相关性.（四） 年度研究计划及预期研究结果2015年1112月：查阅文献，修订并逐渐完善本课题设计,整理已收集的周期血清标本2015年12月：实施代谢组学的集体检测。2016年12月：撰写论文。