去甲泽拉木醛的体外抗真菌作用研究.pdf
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1、 论著 去甲泽拉木醛的体外抗真菌作用研究韩蕾1,仲华2,3,王欣荣2,王彦1,2,3(1.福建中医药大学药学院,福建 福州 350122;2.海军军医大学药学系,上海 200433;3.真菌感染性疾病教育部医药基础研究创新中心,上海 200433)摘要目的研究去甲泽拉木醛的体外抗真菌作用。方法采用微量液基稀释法测定去甲泽拉木醛与氟康唑单独应用于 23 株真菌的最低抑菌浓度(MIC),以棋盘式微量液基稀释法测定两药联合抗耐药白念珠菌的协同指数(FICI),判断两药联合抗菌效果;并通过纸片扩散实验直观验证两药联合的协同作用。最后通过 CCK-8 法测定去甲泽拉木醛的细胞毒性。结果去甲泽拉木醛单用时
2、呈现广谱的抗真菌作用,MIC 范围为 432 g/L。两药联用时,可将氟康唑的有效浓度从大于 64 g/L 降至 0.25 g/L,FICI 值介于 0.1290.254 之间,两药表现出协同抗耐药白念珠菌作用。CCK-8 结果显示,去甲泽拉木醛在高于 MIC 值 4 倍浓度下才展示出细胞毒性。结论去甲泽拉木醛表现出较好的抗真菌作用,与氟康唑联合时有很好的协同效果,且毒性较低。关键词 白念珠菌;去甲泽拉木醛;氟康唑;协同作用;耐药文章编号 2097-2024(2024)04-0151-06DOI 10.12206/j.issn.2097-2024.202310011Studyonantifun
3、galeffectofdemethylzelamaldehydein vitroHAN Lei1,ZHONG Hua2,3,WANG Xinrong2,WANG Yan1,2,3(1.School of Pharmacy,Fujian University of Traditional ChineseMedicine,Fuzhou 350122,China;2.School of Pharmacy,Naval Medical University,Shanghai 200433,China;3.Innovation Centerfor Medical Basic Research on Fun
4、gal Infectious Diseases,Ministry of Education,Shanghai 200433,China)AbstractObjective To study the antifungal effect of demethylzelamaldehyde in vitro.Methods The minimuminhibitory concentrations(MIC)of demethylzeylasteral and fluconazole against 23 fungal strains were determined by micro liquiddilu
5、tion method.The synergistic index(FICI)of the two drugs was determined using a checkerboard micro liquid dilution method.The synergistic effect of the combination of the two drugs was visually verified by paper diffusion experiments.Finally,thecytotoxicity of demethylzelamaldehyde was determined by
6、CCK-8 method.Results Demethylzelamaldehyde showed a broadspectrum of antifungal activity when used alone,with MICs ranging from 4 g/L to 32 g/L.When combined with fluconazole,theeffective concentration of fluconazole could be reduced from over 64 g/L to 0.25 g/L,with FICI values ranging from 0.129 t
7、o 0.254,indicating the synergistic effect of the two drugs.The CCK-8 results showed that demethylzeylasteral exhibited cytotoxicity only atconcentrations four times higher than the MIC value.Conclusion Demethylzelamaldehyde exhibited good antifungal effect andsynergistic effect with fluconazole,and
8、its toxicity was low.Keywords Candida albicans;demethylzeylasteral;fluconazole;synergistic effects;drug resistance近年来,侵袭性真菌感染(IFD)的发病率和病死率逐年增高,临床上常见的侵袭性真菌主要有以念珠菌为主的酵母样真菌和以曲霉为主的丝状真菌。而念珠菌引起的 IFD 的总发病率达 0.03%0.50%,病死率可达 35%80%1,白念珠菌(Candidaalbicans)是侵袭性真菌感染中最常见的致病真菌,约占 40.1%2。尽管目前已研发出有效的抗真菌药物可供临床治疗,但仍存
9、在着耐药性、价格昂贵、毒性大等问题亟需解决3。随着抗真菌药物经年累月使用,耐药性问题越发突出。唑类药物是临床常用的抗真菌药物,疗效好、毒性低,但因应用历史较长,临床上对其耐药的真菌越来越多4。目前,临床可选择的药物数量有限,解决真菌对药物的耐药性问题便成为一个必须攻克的难关。联合用药是一种有效的克服药物耐药性的方法,两者的协同作用不仅可以克服药物的耐药性,还可以增强原有药物的抗真菌作用4。去甲泽拉木醛(DMZ)是从雷公藤根皮中提取的三萜类单体化合物,是雷公藤中含量较高的单体成分,其分子式是 C29H36O6(图 1)。DMZ 具有抗 基金项目军队生物安全项目(20SWAQX29-1-6,145
10、AHQ082021000X);国家自然科学基金(82204470)作者简介韩 蕾,硕 士 研 究 生,Tel:13917309698,Email:通信作者王彦,博士,教授,博士生导师,研究方向:药理学,Email: 药学实践与服务2024 年 4 月 25 日第 42 卷第 4 期 Journal of Pharmaceutical Practice and Service,Vol.42,No.4,April 25,2024151 炎、抗癌、免疫调节、抗生育、雌激素代谢调节等药理活性5,但其在抗真菌方面的研究尚未见报道。本研究发现,DMZ 具有良好的广谱抗真菌活性,并且与氟康唑联合使用具有协同
11、抗耐药真菌作用。OOOOHHOHOH图 1DMZ 的化学结构 1实验材料 1.1 实验菌株及细胞白念珠菌实验株 SC5314 来自美国 Georgetown大学。白念珠菌(C.albicans)临床株 103、7 879、9 161、10 066、9 296、10 060、10 061、7 654、901、904、632,耳念珠菌(Candida auris)0029,克柔念珠菌(Candida krusei)62 588、4 996、10 153,热带念珠菌(Candida tropicalis)8 915、409,烟 曲 霉(Aspergillus fumigatus)7 544,近 平
12、滑 念 珠 菌(Candida parapsilosis)22 019、90 018,须毛癣菌(Trichophyton mentagrophytes)T5a、T5b 由海军军医大学第二附属医院提供。小鼠胚胎成纤维细胞(NIH/3T3)来自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。1.2 实验试剂DMZ 购自陶术生物有限公司;氟康唑(FLC)购自 Macklin 公司;二甲基亚砜(DMSO)购自国药集团化学试剂有限公司。1.3 培养基及其配制YPD 培养液:酵母浸膏 10.0 g,蛋白胨 20.0 g。D-葡萄糖 20.0 g,加超纯水 800 ml 溶解,再以超纯水定容至 1 000 ml,经高
13、压蒸汽灭菌(121C,15 min),自然冷却至室温后于 4C 保存备用。PBS 缓冲溶液:NaCl 8.0 g,Na2HPO412H2O3.57 g,KCl 0.2 g,KH2PO4 0.24 g,用三蒸水溶解并定容至 1 000 ml,高温高压灭菌(121C,15 min)后室温保存。RPMI 1 640 培养基:RPMI 1 640(Gibco BRL)10.0 g,NaHCO3 2.0 g,3-吗啉丙磺酸(MOPS)34.5 g,NaOH 2.7 g,以超纯水定容至 1 000 ml,经 0.22 m微孔滤膜抽滤灭菌后于 4C 保存备用。含药 SDA 培养基:蛋白胨 10 g,D-葡萄
14、糖 40 g,琼脂 20 g,加超纯水 800 ml 溶解,调整 PH 为 7.0,以超纯水定容至 1 000 ml,高压蒸汽灭菌(121,15 min)。待冷却至 5055,将适当药物溶液加入液体状态的 SDA 培养液中,混合均匀,分倒入 9 mm细菌培养皿中,自然冷却凝固后于 4 保存备用。DMEM 完全培养基:45 ml DMEM 高糖培养基中加入 5 ml 小牛血清,充分混匀后置于 4 保存。1.4 仪器生物安全柜(BSC-1004II A2,苏州安泰空气技术有限公司);生物显微镜(LW100T,北京测维光电技术有限公司);霉菌培养箱(MJ-150-I,上海一恒科学仪器有限公司);酶标
15、仪(Thermo MultiskanFC,赛默飞世尔上海仪器有限公司)。2实验方法 2.1 待测菌株的活化及菌悬液的配制于80C 低温保存箱中取出冻存的待测菌株,吸取 10 l 菌液加入装有 1 ml YPD 培养液的 15 ml玻璃摇菌管中,置于 30C 气浴恒温振荡培养箱中,200 r/min 振荡培养。24 h 后从 YPD 菌悬液中吸取 10 l 加入到新的 1 ml YPD 培养液中,继续 30C振荡培养 16 h,活化完成,此时的真菌即处于指数生长末期。取处于指数生长末期的待测菌株置于 1.5 ml离心管中,离心(3 000 r/min,1 min),吸弃上清液,用 1 ml PB
16、S 缓冲溶液洗涤菌株,离心(3 000 r/min,1 min),吸弃上清液,重复洗涤 3 次。取 10 l 真菌原液稀释 100 倍后,使用血细胞计数板于生物显微镜下计数,计算出真菌原液的菌浓度,然后用 RPMI1 640 培养液稀释配制成实验所需浓度的菌悬液。2.2 微量液基稀释法测定最低抑菌浓度(MIC)根据 CLSI 出版的微量液基稀释法实验手册M27-A3 所推荐的标准实验方法来测定6。取处于指数生长末期的待测菌株,用 RPMI 1 640 培养基稀释配置成 1103 CFU/ml 的菌悬液。取 96 孔细胞培养板,于第 1 列加入 100 l RPMI 1 640 培养基作为空白对
17、照;第 2 列加入 200 l 菌液,312 列加入 100 l 菌液,于第 2 列每孔分别加入 6.4 l 药液,依次 2 倍倍比稀释至 11 列,最高药物浓度为64 g/L,12 号孔菌液作为生长对照。96 孔板置于30C 恒温培养箱中静置培养(白念珠菌 24 h,烟曲霉 48 h),之后用酶标仪测定 630 nm 处 A 值。与生长对照孔比较,抑制 80%以上真菌生长对应的最低药物浓度即为 MIC80。实验至少重复 3 次,取较 药学实践与服务2024 年 4 月 25 日第 42 卷第 4 期 152Journal of Pharmaceutical Practice and Serv
18、ice,Vol.42,No.4,April 25,2024 为稳定的结果作为最终的测定结果。2.3 棋盘式微量液基稀释法考察两药合用的协同效果取处于指数生长末期的待测菌株,用 RPMI 1640培养基稀释配置成 1103 CFU/ml 的菌悬液。将配制好的菌悬液涡旋均匀后,转移至 6 孔细胞培养板中,第 1 孔加入 2.6 ml,第 26 孔每孔加入 1.3 ml。取 83.2 l 待测化合物溶液加入第 1 孔中使其终浓度为 64 g/L,依次进行倍半稀释,使得第 16 孔中的化合物终浓度分别为 64、32、16、8、4、2 g/L。将在 6 孔细胞培养板中配制好的含药菌悬液按化合物浓度从高到
19、低(642 g/L)依次对应转移至96 孔细胞培养板的 AF 行中,第 1 列每孔加入200 l,第 210 列每孔加入 100 l。第 11 列的A11F11 孔和第 G 行的 G1G10 孔中加入未加药的空白菌悬液 100 l/孔。将配制好的 FLC 溶液分别加入第 1 列的 A1G1 孔中,每孔加入 6.4 l使其终浓度为64 g/L。各列从左到右依次进行倍半稀释,使得第 19 列的 FLC 终浓度分别为 640.25 g/L。96 孔细胞培养板第 11 列的 A11F11孔中为未加任何药物作用的菌悬液,作为阴性对照组。第 12 列和 H 行各孔中分别加入 100 l 的RPMI 164
20、0 培养液,作为空白对照组。将 96 孔细胞培养板置于 30C 恒温培养箱中静置培养,48 h后使用酶标仪测定每孔真菌在 630 nm 处的光密度值 A630。以阴性对照组的 A630值为 100%,利用公式计算协同指数 FICI。FICI 的计算公式为:FICI=MIC80 化合物(联用)/MIC80 化合物(单用)+MIC80FLC(联用)/MIC80 FLC(单用)2.4 纸片扩散实验取己洗涤的待测真菌,用 PBS 缓冲溶液稀释配制成实验所需浓度(1x106 CFU/ml)的菌悬液,吸取 100 l 均匀涂布于含药的 SDA 培养基中(考察协同作用时培养基中应加入适宜浓度的 DMZ)。在
21、培养基中等距放置 7 枚灭菌纸片,向纸片中滴加药液,使纸片载药量分别为 0、2、4、8、16、32 g(载药量视实验情况而定),置于 30C 恒温培养箱中静置培养 48 h,观察真菌生长情况并拍照记录7。2.5 CCK-8 法考察药物的细胞毒性取小鼠胚胎成纤维细胞(NIH/3T3),胰酶消化后,离心收集细胞并用 DMEM 完全培养基重悬。血细胞计数板计数后调整细胞密度至 5x104个/ml。取 96 孔板划分出实验区、对照区、无细胞区。实验区、对照区每孔加入 100 l 细胞液,无细胞区加100 l DMEM 完全培养基,注意尽量使孔内细胞分布均匀。细胞于 37C 培养箱中贴壁过夜。第2 天,
22、取无菌 EP 管,用 DMEM 完全培养基对待测药物进行倍比稀释,随后取出 96 孔板,吸弃培养基。每孔加 100 l 含不同浓度药物的 DMEM 完全培养基,37C 继续孵育 24 h。取出 96 孔板,吸弃培养基,每孔加 110 l 含 CCK-8 的 DMEM 完全培养基(CCK-8DMEM 完全培养基=110),37C孵育 2 h。测量各孔的 A450。处理结果时用实验区、对照区 A 值减去无细胞区的 A 值,以对照区细胞活力为 1.0,计算各组细胞活力。重复 3 次实验,用 GraphPad 作图并统计分析。3实验结果 3.1 DMZ 的抗菌谱测定 DMZ 对临床中常见的病原真菌的抗
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