一种改良苏木素染液在病理学中的应用.pdf
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1、中文科技期刊数据库(全文版)医药卫生 收稿日期:2023 年 12 月 21 日 作者简介:杨昆(1992),男,汉族,广西贵港人,初级职称,本科生,研究方向为病理学技术。-203-一种改良苏木素染液在病理学中的应用 杨 昆 贵港市中西医结合骨科医院,广西 贵港 537100 摘要:摘要:形态学诊断的准确性是诊断病理学的基石。苏木素和伊红染色在形态学诊断中起着关键作用,其中用于核染色的苏木素更是决定切片质量的最重要因素之一。然而,常用的 Harris 苏木素有一些缺点,包括染液寿命短、易形成氧化膜和底部沉淀。为了解决这些缺点,本研究改良了常用的 Harris 苏木素配方。结果发现,改良的 Ha
2、rris 苏木素提高了切片的 HE 染色的分辨率、切片染色优良率。此外,改良的 Harris 苏木素不会在需要更换前在表面形成氧化膜和底部形成沉淀,因此染液的稳定性更高。本研究通过优化常用的 Harris 染液,提高切片的染色质量,为临床提供更准确的病理诊断。关键词:关键词:比较;苏木素;改良;稳定性 中图分类号:中图分类号:R361 Application of a modified hematoxylin stain in pathology Yang Kun Guigang Integrated Chinese and Western Medicine Orthopedic Hospit
3、al,Gunagxi Guigang 537100 Abstract:The accuracy of morphological diagnosis is the cornerstone of diagnostic pathology.Hematoxylin and eosin staining play a key role in morphological diagnosis,with hematoxylin for nuclear staining being one of the most important determinants of section quality.Howeve
4、r,the commonly used Harris Hematoxylin has some drawbacks,including complicated stain preparation,short stain life,and susceptibility to formation of oxidized film and bottom precipitation.In order to solve these drawbacks,this study modified the commonly used Harris hematoxylin formulation by using
5、 aluminum sulfate instead of potassium alum as the mordant,potassium iodate instead of sodium iodate as the oxidizing agent,ethylene glycol instead of glycerol as the antioxidant,and citric acid instead of glacial acetic acid for controlling the pH value of the dye solution.It was found that the mod
6、ified Harris hematoxylin improved the resolution of HE staining of the sections,and the section staining excellence.In addition,compared with the commonly used Harris hematoxylin,the modified Harris hematoxylin does not form an oxidized film on the surface and a precipitate at the bottom before it n
7、eeds to be replaced,so that more satisfactorily stained sections can be obtained and the stability of the staining solution is higher.By optimizing the commonly used Harris stain,this study aims to improve the quality of staining of sections,which in turn improves the quality of pathology diagnosis
8、providing more accurate pathology diagnosis in the clinic.Keywords:comparison;Hematoxylin;Improvement;stabilit 0 引言 尽管在病理学中出现了分子病理和免疫组化的方法,但形态学诊断仍然是病理学诊断的基石,而苏木素染液也是目前病理学中常用的染液1。然而在日常病理工作中观察到,Harris 染液会在表面形成氧化膜以及染液底部析出结晶,从而产生大量的沉淀,会导致在染色过程中常在切片组织上形成沉淀影响镜检2,以及使用寿命短等缺点。Llewellyn 报告说,微小而细致的修改可以优化现有的染色方
9、法,这将有利于病中文科技期刊数据库(全文版)医药卫生-204-理实验室的染色3。本研究通过优化常用 Harris 配方解决其存在的缺点。改进其性能以提高切片的质量,最终将有助于提高病理诊断的准确性。1 材料和方法 1.1 标本 从贵港市中西医结合骨科医院 2023 年 1 月 16 日-4 月 16 日获得的病理标本中随机抽取 105 例。病理标本分为肠、肺和其他标本 3 大类,每类标本 35 例,标本取材后,固定在 10%中性福尔马林缓冲液中,随后 使 用 全 自 动 组 织 脱 水 机(Leica HistoCore PEGASUS)对上述标本进行脱水,然后进行包埋,并以 3m 的厚度连续
10、切片4。1.2 仪器与试剂 实验中使用了以下设备和试剂:全自动组织脱水机(Leica HistoCore PEGASUS),半自动切 片机(Leica HistoCore MULTICUT)。无水苏木精粉(MW 302),1%伊红 Y 染液,硫酸铝(A12(SO4)3.16H2O)、硫酸铝(KAl(SO4).12HO)、柠檬酸(无水柠檬酸)、蒸馏水、自来水、1%盐酸乙醇、二甲苯、乙醇(75%、85%和 95%)和无水乙醇。无水苏木精粉(MW 302)和 1%伊红 Y 染色剂购自 Sigma-Aldrich(St.Louis,MO,USA)。所有化学品都是试剂级的。1.3 方法 每例标本切 2
11、张空白组织切片,将切片平均分为常用组和改良组,然后将切片分别放入常用 Harris染液与改良 Harris 染液中,在同一染色程序下进行染色(染色程序见下文)。为了评估改良的 Harris 方法的染色质量和稳定性,进行了一系列的对比实验。这项研究是根据赫尔辛基宣言的准则进行的。该研究和样本采集的已获得贵港市中西医结合骨科医院伦理委员会的审核批准。所有组织样本均已确认所有参与者和/或其法定监护人的知情同意。1.4 常用的 Harris 苏木素的配方(250mL)将苏木精(1 g)溶于 10 mL 无水乙醇中以形成溶液 A。同时,将 20g 钾明矾加热溶解在 200mL 蒸馏水中形成溶液 B.然后
12、将溶液 A 倒入溶液 B 中,煮沸 1分钟,随后冷却。当溶液停止鼓泡时,缓慢加入 0.2g碘酸钠,加热溶液至变为紫红色。冷却后,加入 8 mL冰醋酸。最后,加入 32mL 甘油形成甘油苏木素(glychemalum)5。染液在使用前通过滤纸过滤。(见表 1)。1.5 改良 Harris 苏木素的配方(250 mL)将苏木精(1g)在均匀搅拌下溶于 10mL 无水乙醇中,形成溶液 A。接着,将 8g 硫酸铝在均匀搅拌下溶解在 200mL 蒸馏水中,形成溶液 B.将溶液 A 和 B 混合,煮沸,然后将装有溶液 A、B 的混合物的锥形瓶从火上移开。缓慢加入 0.1g 碘酸钾后,将溶液煮沸 1分钟,随
13、后冷却。加入柠檬酸(0.4g),搅拌混合物 5分钟。最后,加入 40 mL 乙二醇,充分搅拌溶液,得到最终的苏木素染液。使用 pH 计测量染液的 pH 值为 2.5,染液无需过滤即可使用(见表 1)。表 1 常用 Harris 苏木素与改良 Harris 苏木素成分的对比(250 mL)成分 苏木精 常用 Harris苏木素 改良 Harris苏木素 1 蒸馏水 200 mL 200 mL 2 无水乙醇 10 mL 10 mL 3 无水苏木精 1 g 1 g 4 氧化剂 NI=0.2 g KI=0.1 g 5 媒染剂 K alum=20 g Al sulfate=8 g 6 酸 Ac=8 mL
14、 Cit=0.4 g 7 其他 Gl=32 mL EG=40 mL NI:碘酸钠;KI,:碘酸钾;K alum:钾明矾;Al sulfate:硫酸铝;Ac:冰醋酸;Cit:柠檬酸;Gl,:甘油;EG:乙二醇;1.6 染色程序 切片使用二甲苯进行脱蜡和使用梯度酒精进行水化。切片用两种染液染色 5 分钟。切片在流动的自来水中充分清洗 30 秒。切片在 1%盐酸乙醇(1%HCl 溶于 75%乙醇)中分化 3 秒。切片在自来水中充分清洗,直到变成 蓝色(即返蓝),通常需要 5 分钟 6。切片用 1%的伊红 Y 染色 1 分钟。然后用梯度酒精对切片进行脱水、二甲苯透明和中性树胶安装。1.7 Gill 测
15、量令人满意地染色的切片数的方法 为了客观地确定每毫升染液可以令人满意地染色的切片数量,制备了一组用酒精湿固定口腔涂片,预计每五张片子的架子将染色一张切片。每张切片都标有名称、日期和编号,从 1 开始,以 5 为间隔(即 1、5、10、15 等)。将苏木精-1 放入第一排切片中,让其通过新鲜的苏木素染液,同时避免与任何其他染中文科技期刊数据库(全文版)医药卫生-205-液接触,然后将其取出,脱水,透明并安装。比较测试组的第一张和最后一张切片以确定显著差异。如果注意到这些差异,则确定不利差异开始的切片。切片上的编号表示可进行染色的计数。如果没有观察到差异,则在更换染液之前对其他切片进行染色。口腔涂
16、片用于确定染色的次数7。1.8 试验 1.8.1 试验 1 比较两种染液的染色质量和染色优良率 两种染液均参照表 1 中的配方制备,然后将切片分别放入常用 Harris 染液与改良 Harris 染液进行染色,并以常用的 Harris 苏木素染色切片作为对照。比较染色实验按照标准的实验室染色程序进行(见上文染色程序)。对切片的染色质量进行评分,并比较两组切片染色的优良率。这些切片提交给两名高年资病理医师和一名高年资病理技术员进行双盲评分。评分标准8见表 2。表 2 HE 染色质量的评分标准 项目 分值 得分等级 整体颜色(核质比)1 苏木素 胞核染色 1 核仁清晰 1 1-5 分为差 背景异染
17、 1 伊红 6-9 为良 胞质染色 1 结缔组织染色 1 10 分为优 无掉片 2 无污染 1 封片完整无溢胶 1 总分 10 1.8.2 试验 2 比较过滤对染液的影响 常用 Harris 染液(500mL)被平均分在两个玻璃缸中。一个玻璃缸定期过滤,以去除表面氧化膜;另一个玻璃缸不作处理,让表面氧化膜形成。然后使用 Gill 所描述的测量方法(见上文 Gill 测量令人满意地染色的切片数的方法)对这两个玻璃缸进行常规染色,以确定每 mL 染液可令人满意地染色的切片数。1.8.3 试验 3 比较两种染液的稳定性 将常用 Harris 染液(250mL)和改良 Harris 染液(250mL)
18、分别放入两个玻璃缸中。定期过滤常用Harris 染液和改良 Harris 染液产生的表面氧化膜。然后使用这两个玻璃缸进行常规染色,采用与 Gill所述测量方法(见上文 Gill 测量令人满意地染色的切片数的方法),以确定每 mL 染液可令人满意地染色的切片数量。1.8.4 试验 4 比较碘酸钾和碘酸钠在常用的 Harris配方中的效果 常用 Harris 配方用碘酸钾代替碘酸钠,而其他成分保持不变。定期过滤两种染液的表面氧化膜。然后将两种染液用于常规染色,采用与 Gill 所述相同的测量方法(见上文 Gill 测量令人满意地染色的切片数的方法),以确定每 mL 染液可令人满意地染色的切片数量。
19、1.8.5 试验 5 比较碘酸钠和碘酸钾在改良的 Harris配方中的效果 改良的 Harris 配方用碘酸钠代替碘酸钾,而其他成分保持不变。然后使用这两种染液进行常规染色,采用与 Gill 所述相同的测量方法(见上文 Gill 测量令人满意地染色的切片数的方法),以确定每 mL 染液可令人满意地染色的切片数量。1.9 统计学处理 使用 SPSS26.0 软件进行统计学数据处理,=0.05 为检验水准,两组间优良百分率的比较采用非参数秩和检验。2 结果 试验 1:与常用的 Harris 苏木素相比,改良的 Harris 苏木素具有更高的染色能力(染色强度更深)、更高的核选择性(染色强度更深,核
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