长链非编码RNAH19在乳腺癌组织中的表达及临床意义.pdf
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1、中文科技期刊数据库(全文版)医药卫生 收稿日期:2024 年 01 月 23 日 作者简介:成端辉(1972),男,壮族,广西来宾人,研究生,副主任医师,研究方向为普通外科。-78-长链非编码 RNAH19 在乳腺癌组织中的表达及临床意义 成端辉 南宁市第六人民医院,广西 南宁 530003 摘要:摘要:目的 为探讨长链非编码 RNA H19 在乳腺癌组织中的表达及其在临床上的意义。采用实时荧光定量 PCR 对2013 年 1 月至 2013 年 12 月手术切除的 68 对乳腺癌组织及相应癌旁组织的 H19 水平进行检测。通过受试者工作特征(ROC)曲线评估 H19 在乳腺癌诊断中的价值,并
2、分析其与乳腺癌的临床病理参数的关系。应用 Kaplan-Meier法探讨 H19 的表达与患者生存率之间的关系,并通过单因素及 Cox 多因素比例风险模型分析影响乳腺癌预后的因素。结果 乳腺癌组织中 H19 的相对表达量显著高于癌旁组织(2.0050.709vs.1.1090.387,P0.001)。H19的 ROC 曲线下面积为 0.850,诊断阈值为 1.66,约登指数为 0.647,特异度和敏感度分别为 94.1%和 70.6%。H19的表达与淋巴结转移(P=0.001)、组织分化程度(P=0.002)、TNM 分期(P=0.002)及 HER-2 表达状态(P=0.036)相关,但与年
3、龄、肿瘤直径、ER、PR 以及组织学类型无显著关联(P0.05)。高表达 H19 的患者无进展生存率及总生存率较低表达者降低(P0.05)。Cox 多因素回归模型分析结果表明,H19 的表达、淋巴结转移、TNM 分期和HER-2 表达是影响乳腺癌患者预后的独立因素(P0.05)。综上所述,H19 在乳腺癌组织中呈现高表达,参与乳腺癌的发生和发展,可能成为乳腺癌早期诊断和评估预后的潜在靶点。关键词:关键词:乳腺癌;长链非编码 RNA;H19;预后 中图分类号:中图分类号:R737.9 乳腺癌作为女性最常见的恶性肿瘤之一,每年在全球范围内约有 170 万人被确诊罹患,其中大约有 50万人因该病丧生
4、。尽管全球对乳腺癌的诊断和治疗有所进展,但在发展中国家,乳腺癌的发病率依然呈上升趋势1。这突显了对乳腺癌发病机制的深入研究的紧迫性,同时也强调了寻找新的治疗和检测目标的重要性。其中,长链非编码 RNA(lncRNA)引起了广泛的关注。这类 RNA 分子的长度超过 200 核苷酸,虽然不涉及蛋白质编码,但在细胞生物学中扮演着关键的角色。尤其在近年的研究中,lncRNA 已被证实与多种肿瘤的生物学特性密切相关,其中包括调控肿瘤细胞的增殖、分化和凋亡等重要过程2-4。这为深入了解乳腺癌的发病机制提供了新的视角,并为寻找创新的治疗策略和检测指标打开了大门。因此,全面理解 lncRNA 在乳腺癌中的作用
5、,不仅有助于揭示乳腺癌发生发展的分子机制,也为未来研究中的治疗目标提供了潜在的方向。lncRNA H19(H19)是 lncRNA 的一种,人 H19 长度为 2.3 kb,定位在染色体 11p15.55,能够参与哺乳动物早期胚胎发育,其表达量在组织器官成熟后逐渐下调。近年来研究表明,H19 的表达水平在多种恶性肿瘤中重新上调,并在肿瘤的进展转移过程中发挥重要作用。Zhu 等6研究发现 H19 可以通过抑制 E-cadherin的表达从而促进膀胱癌细胞的转移,其表达量与膀胱癌患者的临床分期显著相关。Gao 等7报道 H19 在肺腺癌组织中呈高表达,可通过介导肺腺癌细胞上皮间充质转化促进肿瘤组织
6、的生长,上述结果均表明 H19 能够作为原癌基因发挥作用。但是关于 H19 在乳腺癌组织中的表达情况及其与患者预后的关系尚未有学者报道。因此,选择使用实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)来检测乳腺癌组织中 H19 的表达水平,并分析其与患者的临床病理特征和预后之间的关系。通过这一研究,旨在深入探讨 H19 是否具有作为乳腺癌预后评估分子标志物的潜在价值。1 资料与方法 1.1 临床资料 为深入了解乳腺癌的临床和组织学特征,我们在南宁市第六人民医院展开了一项全面的研究。该研究的时间跨度自 2013 年 1 月至 2013 年 12 月,期间我们收集了 68 对乳腺癌组织和相应的癌旁组织标本,确
7、保癌旁组织距离原发灶超过 5 厘米。这一步骤旨在确保我们的研究样本具有代表性,以更全面地了解乳腺癌中文科技期刊数据库(全文版)医药卫生-79-的发展。所有参与研究的患者均经过病理学的确诊,确保我们研究的对象均为乳腺癌患者。研究对象的年龄跨度在 36 到 69 岁之间,中位年龄为 48 岁,涵盖了不同年龄段的乳腺癌患者,为我们研究的广泛性提供了支持。通过对患者的临床 TNM 分期进行详细分析,我们发现 10 例为 I 期,14 例为 II 期,44 例为 III 期,其中 45 例发生了淋巴结转移。这些数据有助于我们更好地了解乳腺癌在不同发展阶段的临床表现。组织学分析涉及不同类型的乳腺癌,包括5
8、6例浸润性导管癌、8 例浸润性小叶癌以及 4 例混合型乳腺癌。此外,在分化程度方面,我们观察到 8 例高分化,18 例中等分化,以及 42 例低分化的病例。这有助于细致地描绘乳腺癌的组织学特征。进一步地关注了雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)和 HER-2 的表达情况。我们发现 40 例患者为 ER 阳性,38 例为 PR 阳性,而 22 例为 HER-2阳性。这些结果对于了解乳腺癌亚型和治疗选择提供了重要线索。强调研究的伦理合规性。南宁市第六人民医院伦理委员会已经批准了此项研究,同时,我们确保所有参与研究的患者都在事先签署了知情同意书,确保他们对研究的目的和过程有清晰的了解。这一伦理审查
9、和知情同意的过程是确保研究合法、透明的重要步骤。1.2 主要试剂 SYBR R Premix Ex TaqTM II、PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser、TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit、目的基因 H19 引物与内参 GAPDH 均购自广西科迪试剂公司。1.3 总 RNA 提取与 cDNA 合成 在本研究中,实施了一套系统的实验流程,以获得乳腺癌组织和相应癌旁组织的 RNA。首先,将这些组织样本放置于 Trizol 试剂中,并通过研磨和混合等步骤,确保充分裂解细胞结构,释放 RNA。
10、接下来,通过低温离心的方式,我们有效地分离了上清液,其中包含了我们所需的 RNA 成分,并将其收集置于 EP 管中。为了提高 RNA 的纯度,我们引入了氯仿和异丙醇的处理步骤。具体而言,我们加入了氯仿并进行强烈的振荡,随后在冰上进行冷藏。这个过程有效地去除了上清液中的杂质,为后续的 RNA 处理奠定了基础。紧接着,我们加入了等体积的异丙醇,摇匀后再次冷藏,最终弃去上清液。为进一步净化 RNA,我们引入了 75%乙醇的处理步骤,通过振荡和离心的操作,成功地收集了 RNA 的沉淀,并在 510 分钟内将其干燥并混匀。为了确保我们获得的 RNA 具有高质量和适当的浓度,我们使用了凝胶电泳系统进行检测
11、。这个步骤不仅可以评估 RNA 的完整性,还能够检测是否存在任何污染或降解。最后,为了进一步的分析,我们按照试剂盒说明书的详细步骤,配置了逆转录反应体系,将提取得到的总 RNA 转录成 cDNA。这一系列操作的严密执行为我们后续的实验和数据分析提供了可靠的基础。1.4 qRT-PCR 法检测 H19 的相对表达量 在冰上制备 PCR 反应液,包括 SYBRPremixExTaqTMII10L、H19 上下游引物各 0.8L、cDNA 模板 2L、荧光显色剂 0.4L 以及灭菌蒸馏水 6L,总体积为 20L。扩增过程采用 Real-TimePCRSystem 进行,使用H19 特异性引物和内参
12、GAPDH 特异性引物。H19 引物序列为上游 5-GGCAAGAAGCGGGTCTGT-3,下游 5-GTGCAGCATATTCATTTCCAAG-3;GAPDH 引物序列上游为 5-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3,下游为 5-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3。PCR 反应条件为变性 9515s,退火 6025s,延伸 7234s,循环 40 次。利用内参 GAPDH,通过 2Ct 方法8计算 H19 基因的表达水平。这一实验方案的设计和操作确保了对 H19 基因表达量的准确测定。1.5 随访 研究中制定了系统的术后随访计划,包括第 1 个月、第 1 年、第 2 年
13、及随后每年的定期随访,截至 2018年 12 月 31 日。总计 68 例患者参与了随访,跨足 6 至72 个月,中位随访时间为 60 个月。在此期间,33 例患者出现复发或转移,25 例不幸死亡,死因主要与乳腺癌复发或转移有关,另有 2 例患者失访。1.6 统计学分析 为深入了解研究对象的情况,我们运用 SPSS 19.0软件进行了全面的统计学分析。计量资料使用均数标准差表示,并通过独立样本 t 检验比较两组数据。计数资料则采用率表示,组间比较通过2 检验和Fishers 精确概率检验进行。通过受试者工作特征(ROC)曲线评估组织 H19 水平对乳腺癌的诊断效能。在生存分析方面,我们运用 K
14、aplan-Meier 法,并进行Log-rank 检验。为全面了解影响乳腺癌预后的因素,我们采用单因素及 Cox 比例风险模型分析,其中 P中文科技期刊数据库(全文版)医药卫生-80-0.05 表示差异具有统计学意义。这一系列详尽的分析方法确保了对乳腺癌患者预后的全面评估,为研究结果的科学解释提供了坚实的基础。2 结果 2.1 H19 在乳腺癌组织中的表达 qRT-PCR 结果显示,H19 在 68 例乳腺癌组织及相应癌旁组织的相对表达量分别为 2.005 0.709、1.109 0.387,两者比较差异具有统计学意义(t=9.148,P0.001)。H19 表达诊断乳腺癌 ROC 曲线下面
15、积为 0.850(95%CI:0.7830.917,P0.001),诊断阈值 1.66,约登指数 0.647,特异度和敏感度分别为 94.1%和 70.6%,表明当 H19 相对表达量 1.66 时,乳腺癌发生机会增加。见图 1。2.2 H19 表达与乳腺癌患者临床病理特征的关系 以乳腺癌患者组织中H19相对表达量的均值为界,将患者分为 H19 高表达组(37 例)和 H19 低表达组(31例)。统计分析表明,H19 的表达与淋巴结转移(P=0.001)、组织分化程度(P=0.002)、TNM 分期(P=0.002)及 HER-2 表达状态(P=0.036)有关,但与年龄、肿瘤直径、ER、PR
16、 以及组织学类型无关(P 0.05),见表 1。A:H19 在乳腺癌组织和癌旁组织中的表达情况;B:组织 H19诊断乳腺癌的 ROC 曲线 图 1 乳腺癌组织的 H19 水平及诊断效能 2.3 H19 表达与乳腺癌患者预后的关系 采用 Kaplan-Meier 法评估患者的生存时间,结果表明,与低表达 H19 的患者相比,高表达 H19 患者的无进展生存率明显降低(HR=2.148,95%CI:1.0734.204,P=0.032),总生存率也明显低于低表达 H19 的患者(HR=2.741,95%CI:1.1875.701,P=0.018),见图 2。表 1 H19 表达与乳腺癌患者临床病理
17、参数的关系 例(%)临床病理参数 例数 H19 的表达 2值 P 值 高(n=37)低(n=31)年龄(岁)0.040 0.841 50 36 20(55.6)16(44.4)50 32 17(53.1)15(46.9)肿瘤直径(cm)0.093 0.761 2 25 13(52.0)12(48.0)2 43 24(55.8)19(44.2)淋巴结转移 11.241 0.001 无 23 6(26.1)17(73.9)有 45 31(68.9)14(31.1)TNM 分期 9.530 0.002 III 期 24 7(29.2)17(70.8)III 期 44 30(68.2)14(31.8)
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