平谷区马坊镇番茄病毒病的病原鉴定.pdf
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1、北京农学院学报2 0 2 4,39(2):15-2 0Journal of Beijing University of Agriculturehttp:/doi:10.13473/ki.issn.1002-3186.2024.0203平谷区马坊镇番茄病毒病的病原鉴定孙春辉,刘丽,鲁书豪,梁宇卿,王昀轩,崔雯莉,高佳仪,李永强*(北京农学院生物与资源环境学院/农业农村部华北都市农业重点实验室,北京,10 2 2 0 6)摘要:【目的】为了给平谷区马坊镇设施番茄病毒病防治提供依据。【方法】2 0 2 2 年10 月在河北村、果各庄、早立庄、梨羊村、小屯村番茄种植区采集到表现有黄化、蕨叶、褪绿等疑似
2、病毒病症状的番茄叶片,利用小RNA深度测序技术对混合叶片进行病毒筛查,并利用PCR/RT-PCR验证。【结果】侵染当地番茄的病毒种类有黄瓜花叶病毒(cucumber mosaic virus)、南方番茄病毒(southern tomato virus)、番茄褪绿病毒(tomatochlorosis virus,T o CV)和番茄黄化曲叶病毒(tomato yellowleaf curl virus,T Y L CV),在12 份样品中的病毒检出率依次为58.3%、16.7%、16.7%、10 0%,两种及以上病毒复合侵染率为58.3%,并通过对5个TYLCV进行全序列扩增及构建系统发育树,表
3、明其均与TYLCV北京分离物的亲缘关系最近。【结论】病毒病在马坊镇普遍发生且危害较为严重,检测结果表明,TYLCV是侵染当地番茄的主要病毒,且复合侵染现象严重。关键词:设施;番茄;病毒病;病原鉴定;小RNA深度测序中图分类号:S432.1文章编号:10 0 2-318 6(2 0 2 4)0 2-0 0 15-0 6 文献标志码:APathogen(s)identification of tomato viral disease inMafang Town,Pinggu DistrictSUN Chunhui,LIU Li,LU Shuhao,LIANG Yuqing,WANG Yunxuan
4、,CUN Wenli,GAO Jiayi,LI Yongqiang(College of Bioscience and Resource Environment/Key Laboratory of Urban Agriculture(North China),Ministry of Agriculture and Rural Affairs,Beijing University of Agriculture,Beijing 102206,China)Abstract:ObjectiveJTo clarify the pathogen of tomato viral disease in Maf
5、ang Town,Pinggu District,and provide a basis forthe prevention and control of tomato virus disease in this area.MethodsJIn October 2022,tomato leaves from Hebei Village,Guogezhuang Village,Zaolizhuang Village,Liyang Village,and Xiaotun Village showing symptoms of viral diseases includingyellowing,fe
6、rn leaves and chlorosis were collected and screened of potential viruses by small RNA deep sequencing,and the i-dentified viruses were further verified by PCR/RT-PCR.ResultsJThe main virus species infecting tomato plants were cucum-ber mosaic yirus(CMV),southern tomato virus(STV),tomato chlorosis vi
7、rus(ToCV)and tomato yellow leaf curl virus(TYLCV).The detection rates of the corresponding virus in the 12 samples were 58.3%,16.7%,16.7%,and 100%,and themixed infection rate of two or more viruses was 58.3%,by performing full-genome amplification and constructing phylogenetictrees of 5 TYLCV,it was
8、 indicated that all of them are most closely related to the TYLCV isolates from Beijing.ConclusionThe viral disease was widespread and severe in Mafang town,and the test results indicated that TYLCV was the main virus in-festing local tomatoes,and mixed infection is common.Keywords:facility;tomato;v
9、irus disease;pathogen identification;small RNA deep sequencing近年来,随着安全饮食观念的不断深人,蔬菜产业在世界范围内得到了迅猛的发展,其种植区域不断扩大,带来巨大的经济效益 1。番茄(Solanumlycopersicum)营养价值高,广受欢迎,是全球蔬菜作物中产量最高的种类 2 。中国的番茄产业生产规模宏大,其产量居各国之首,在市场进出口作物中收稿日期:2 0 2 4-0 1-2 2基金项目:北京市农业农村局乡村振兴项目(2 0 2 2 0 2 0 4-0 3)第一作者:孙春辉,硕士研究生,主要从事植物保护研究,E-mail:S
10、u n 1319936 8 2 0 16 3.c o m,刘丽为共同第一作者通信作者:李永强,博士,副教授,主要从事植物病毒学研究,E-mail:l y q b u a.e d u.c n16占有重要份额。但番茄的生产面临着一重大难题,番茄病毒病发生频繁,难以防控,严重影响番茄的产量和品质,如何有效应对病毒病的发生和发展,是当前番茄产业进一步发展中呕待解决的问题。根据最新报道,国内在番茄中鉴定到的病毒已更新为44种 3。在北京地区,报道的番茄毒原种类主要有番茄花叶病毒(tomato mosaic virus,ToMV)、黄瓜花叶病毒(cucumber mosaic virus,CMV)、马铃薯
11、X病毒(potato virus X,PVX)、马铃薯Y病毒(potato virus Y,PVY)、烟草蚀纹病毒(t o b a c c o e t c h v ir u s,T EV)、首花叶病毒(alfalfamosaicvirus,A M V)、番茄褪绿病毒(tomatochlorosis virus,T o CV)、番茄黄化曲叶病毒(tomatoyellow leaf curl virus,TYLCV)、番茄斑萎病毒(to-mato spotted wilt virus,TSWV)4-7等。同时番茄病毒病在田间的症状表型特别复杂,不同生长周期表现出不同症状,且复合侵染现象严重,对番茄
12、生产造成严重威胁。TYLCV是世界番茄种植区普通存在的一种植物病毒,在已被报道的番茄病毒中危害最大,其寄主除了番茄外,还包括辣椒、菜豆、棉花、拟南芥和烟草等30 多种植物 8 ,主要通过烟粉虱进行传播,不能通过机械摩擦传播。TYLCV在番茄的苗期就可引起发病,通常症状表现为顶部叶片黄化,出现黄绿斑,叶片变小,叶缘向内卷曲,严重时植株矮化,生长停止,不能正常开花结果,对番茄生产造成毁灭性打击。2 0 世纪中期,以色列首次报道了番茄黄化曲叶病毒病,7 0 年代末,引起该病的病原被正式命名为TYLCVE9。2 0 0 6 年,TYLCV在中国上海首次报道 10 1。最近几年,TYLCV已扩散到中国各
13、省市的番茄种植区,每年造成的经济损失高达数十亿元,对番茄产业的发展造成了严重影响。近年来,小RNA深度测序技术在农业病害监测尤其是病毒病原鉴定领域得到广泛应用 1-13。小RNA深度测序技术检测病毒是基于RNA沉默原理的一种检测技术,病毒侵染后会将自身的基因组释放到植物体内,同时会触发植物的抗病毒防御机制,即RNA干扰,通过RNA干扰的方式,植物细胞内形成大量的病毒衍生小干扰RNA(V ir u s-derived small interfering RNAs,vsi RNA),获得这些小RNA序列,再通过生物信息学相关软件分析,将测序数据拼接,就可以获取植物中病毒的序列信息。该研究调查了北京
14、市平谷区马坊镇番茄病毒病的发生情况,并利用小RNA深度测序技术检测北京农学院学报了侵染当地番茄的病毒种类,扩增了5个TYLCV基因组全序列,并对其进行了序列分析和系统发育分析,为当地番茄病毒病的预防和综合防治奠定基础。1材料与方法1.1番茄病毒病样品采集2020年在北京市平谷区马坊镇的河北村、果各庄、早立庄、梨羊村、小屯村的番茄大棚中采集到疑似病毒病的番茄叶片,液氮快速冷冻后放人一8 0 超低温冰箱中保存,以备后续使用。1.2小RNA深度测序的番茄叶片样品处理用植物RNA快速提取试剂盒(Takara)提取番茄叶片样品总RNA,用Nanodrop200o检测RNA样品的质量和浓度,用琼脂糖凝胶电
15、泳和Agilent2100oBioanalyzer检测RNA样品的完整性,当测定质量浓度2 50 ng/L,体积10 L,OD260/2801.8,OD260/2301.0,RIN值7.0 时,样品检测合格。样品检测合格后委托华大基因公司,进行小RNA分离、建库和测序工作。将在河北村采集的KALF-HM、K A L F-X、K A L F-、K A L F-HJ、K A L F-JY 叶片等量混合,命名为KALF;在小屯村采集的YSF-JY、Y SF-T L 叶片等量混合,命名为YSF;将梨羊村采集的LY、早立庄村采集的ZLZ和果各庄村采集的 GGZ-JY、G G Z-H S、G G Z-HJ
16、叶片等量混合,命名为GGZ,分别进行测序。1.3小RNA深度测序数据处理利用Perl语言脚本将小RNA深度测序原始数据中的低质量数据剔除,去除接头序列,得到有效序列(Clean reads),将有效序列通过Bowtie 2软件剔除基因组序列后,与未比对到的小RNA通过vlvet软件进行拼接,获得多个contigs,拼接所得的contigs 通过 NCBI 网站的病毒核酸数据库和蛋白质数据库进行BLAST比对,并对其分类注释。1.4 PCR/RT-PCR法验证根据小RNA测序结果及已有报道,设计候选病毒的特异性引物对其进行验证,引物信息见表1,DNA病毒TYLCV通过PCR方式验证,其余病毒通过
17、RT-PCR方式验证。分别按照植物基因组DNA提取试剂盒(Takara)和植物总RNA提取试剂盒(Takara)的说明书提取病样叶片的总DNA、总RNA。以提取的2 L总RNA为模板,引物Oligo(dT)和Random各添加0.5L,dNTPMixture添加1.0 L,随后用DEPC处理过的水将反应体系体第39卷2024年第2 期积补充至18.5L,将上述反应体系在6 5水浴中孵育5min;向反应体系中添加5XM-MLV逆转录反应缓冲液5L,M-MLV反转录酶1L和RRI抑制剂0.5L,42,1h;7 0,15m i n,合成cDNA(试剂均采购于Takara)。表1用于检测病毒的引物Ta
18、b.1Primer usedfor detecting viruses引物PrimersTYLCVFTYLCVRCMVFCMVRSTVFSTVRToCVFToCVR以合成的cDNA和提取的DNA为模板进行PCR扩增。PCR扩增总体系为2 5.0 L,包括上、下游引物各1.0 L,2 T a q 预混液12.5L,d dH,O8.5L,cDNA2.0L;扩增程序为:9 4预变性5min;94变性30 s;52 6 0 退火30 s;7 2延伸1min,进行35个循环;7 2 补平10 min。扩增结束后,通过琼脂糖凝聚电泳观察片段大小,并将片段进行回收纯化后,克隆至pMD19-T载体(Takar
19、a)中,通过热激法将重组载体转化至大肠杆菌DH5感受态,之后通过菌落PCR鉴定阳性克隆。将阳性克隆送至生工生物工程(上海)技术服务有限公司测序。1.5序列拼接将对阳性克隆测序,获得的病毒序列利用DNAMAN软件进行序列拼接,拼接结果与NCBI中的BLAST进行同源比对分析,并下载相关序列数据。1.6TYLCV全基因组序列扩增根据小RNA深度测序结果,通过vlvet软件拼接得到五条不同的TYLCV序列。分两段对TYLCV全基因组序列进行扩增,所设计的2 对引物信息见表2。感病植株DNA的提取、扩增、回收、连接、及转化参考1.4进行。1.7序列分析和系统发育分析利用DNAMAN软件对扩增获得的TY
20、LCV的序列进行组装。根据NCBI中“ORFFinder”鉴定TYLCV基因组上每个ORF的具体位置,并通过NCBI网站对拼接得到的这五条TLYLCV全长孙春辉等:平谷区马坊镇番茄病毒病的病原鉴定sequence of TYLCV引物PrimersTYLCVF1TYLCVR1引物序列(5-3)TYLCVF2Sequence(5-3)TYLCVR2CGGGATCCACTTCTAAATGCGGGATCCCACATATTGCAAGTGCTAGAAGTACACGGACCGAAGTGATCTCACAAGCAGAATCGACGGGGCCTCATTGATAAGACTATTACGCCATCTCAAGCACAG
21、ATACATCGACGATAGGTGTTTGGAGTCATGGGAGTGTACCTTCAATTTCCTTAACTCGT17序列进行核苷酸一致性分析。表2 TYLCV全长序列扩增所需引物Tab.21Primers required for amplification of the full-lengthACCGGATGGCCGCGCCTTTTTCAAGCAGAGAATGGCGTTTTTAATAGAGGGGAGTGTTTATCTCCCAATATTATACGGATGGCCGCTTT利用MEGA7.0软件,采用最大似然法,根据TYLCV的全序列构建系统发育树,可信度设置为1000次重复,分析其亲缘关系
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