优化前后不同时间段内精子功能变化的初步探讨.pdf

中文科技期刊数据库（全文版）医药卫生 收稿日期：2024 年 01 月 18 日 作者简介：吴卓（1985），女，汉族，广西贵港人，硕士研究生，主治医师，研究方向为生殖医学、体外受精-胚胎移植实验室技术。-95-优化前后不同时间段内精子功能变化的初步探讨 吴 卓 杨 华 李春苑 曾健伟 许常龙（通讯作者）广西南宁市第二人民医院生殖中心，广西 南宁 530031 摘要：摘要：目的 探讨精子功能检查包括精子 DNA 碎片指数，线粒体膜电位以及顶体反应，在精液优化前后不同时间段内的变化趋势。方法 采用流式细胞仪对具有生育能力的 5 例人类精液样本进行精子 DNA 碎片指数(sperm DNA fragmentation index，DFI)，线粒体膜电位（Mitochondrial membrane potential，MMP）以及顶体反应（Acrosome reaction，AR）检测。采用密度梯度离心法+上游孵育法优选精子，根据优化精液前后不同时间段，分为 6 组实验组，分别为优化前，优化后 0 小时，优化后 1 小时，优化后 2 小时，优化后 3 小时及优化后 4 小时；比较 6 组的 DFI,MMP 以及 AR 数值，并分析 6 组的精液功能检查参数的差异。结果 首先比较处理前后精子功能检测，其中DFI,MMP 以及 AR 的 P0.05，表明处理前后精子功能质量具有显著差异；其次处理后 4 小时内 DFI,MMP 以及 AR数值经统计分析比较，P0.05，表明无显著差异。结论 密度梯度法优化后较处理前，精子质量明显提升，但处理后四小时内精子功能无显著变化，本研究对 ART 辅助生殖技术中取精以及授精时间具有一定的指导意义。关键词：关键词：精子 DNA 碎片指数；线粒体膜电位；顶体反应；受精时间 中图分类号：中图分类号：R321.1 Preliminary study on sperm function changes in different time periods before and after optimization WU Zhuo YANG Hua LI Chunyuan ZENG Jianwei XU Changlong(Corresponding author)Reproductive Medicine Center,The Second Nanning Peoples Hospital,Guangxi Nanning 530031 Abstract:Objective to explore the changes of sperm function including sperm DNA fragment index,mitochondrial membrane potential and acrosome response in different time periods before and after semen optimization.Methods 5 human semen samples with fertility were tested by flow cytometry for sperm DFI,MMP and AR.Sperm was optimized by density gradient centrifugation+upstream incubation method.According to different time periods before and after semen optimization,six groups of experimental groups were divided into:before optimization,0 hour after optimization,1 hour after optimization,2 hours after optimization,3 hours after optimization and 4 hours after optimization.DFI,MMP and AR values of 6 groups were compared,and the differences of semen function examination parameters in 6 groups were analyzed.Results firstly,sperm function test before and after treatment was compared,among which DFI,MMP and AR P 0.05,indicating that sperm function quality was significantly different before and after treatment.Secondly,DFI,MMP and AR values within 4 hours after treatment were statistically analyzed and compared,P 0.05,indicating no significant difference.Conclusion the sperm quality was significantly improved after the density-gradient method was optimized compared with that before the treatment,but there was no significant change in sperm function within four hours after the treatment.This study has certain guiding significance for sperm extraction and insemination time in ART assisted reproductive technology.Keywords：Sperm DNA fragment index;Mitochondrial membrane potential;Acrosomal reaction;Fertilization time 中文科技期刊数据库（全文版）医药卫生-96-在临床上应用中，目前主要根据WHO的精液标准，通过对精子活动率、密度、形态等精液参数进行分析，以此来判断男性生育能力。随着当代检验技术的日益发展，精液质量常规分析的准确性得到了很大的提升，但在评估男性不育机制方面，仍然具有一定的局限性。因此，我们需要从宏观和微观等多个方面对精子质量进行综合性评估，才能更深入地了解精子的受精能力。为了更准确地评判男性生育能力和预测生殖结局，临床需要更多、更深入的实验室指标来全面、客观、准确地评估男性生育力，探讨精子自然受精机制，进而准确地反映精子功能，包括精子 DNA 碎片指数、线粒体功能以及顶体反应等。精子 DNA 碎片指数（sperm DNA fragmentation index，DFI)，主要是指发生 DNA 链断裂的精子占全部精子的百分比，反映了遗传物质 DNA 的损伤程度。父方遗传物质 DNA 的完整性对精子功能的影响一直受到广泛的关注，已有研究表明，男性不育除与精子浓度、精子活力、精子形态等相关外，与 DFI 也有一定的关系1。因此检测精子 DFI 对预测精子功能状况有重要的意义。精子线粒体是精子进行有氧呼吸的主要场所和供能中心，主要位于精子中段，它通过氧化磷酸化(oxidative phosphorylation，OXPHOS)反应产生的腺嘌呤核苷三磷酸为精子运动提供能量。而维持线粒体进行氧化磷酸化和产生腺嘌呤核苷三磷酸的关键，则是正常的线粒体膜电位。正常精子细胞能量代谢中，线粒体氧化呼吸产生的能量以电化学势能储存于线粒体内膜，在内膜两侧形成质子及其他离子浓度的不对称分布，形成跨线粒体内膜的跨膜电位，即 MMP2。大量研究表明，线粒体膜电位与精子活率、活力及受精率正相关3-4，因此，精子线粒体膜电位的检测对评定精子质量，指导选择不同的助孕方式具有重要意义。精子顶体内储存多种蛋白水解酶，顶体反应（acrosomal reaction，AR）主要是指精子与卵子相遇后，顶体受体被激活，随着顶体内水解酶的释放，卵母细胞外周的颗粒细胞以及透明带被溶解，最终使得精子成功穿入卵母细胞内的过程。因此，顶体完整性是精子质量检测分析的重要指标，也是决定人工受孕或体外受精（in vitro fertilization；IVF）受精结果的重要参数。而诱发精子顶体反应率的检测，是评估男性生育能力的重要指标之一5。1 资料与方法 1.1 对象与分组 1.1.1 研究对象 选择 2021 年 7 月就诊于南宁市第二人民医院生殖医疗中心，符合纳入标准的 5 例 IVF 助孕患者作为研究对象。纳入标准：女方年龄35 岁，单纯输卵管或盆腔因素不孕；男方排除男性生殖器外伤史，睾丸、附睾以及输精管疾病，选择经密度梯度离心法处理后精子浓度前向运动精子百分率(PR)28106/ml 的患者，并能在取卵当天提供新鲜外周精液。1.1.2 实验分组 根据密度梯度离心法处理精液前后不同时间段分为 6 组，包括处理前，处理后 0 小时，处理后 1 小时，处理后 2 小时，处理后 3 小时，处理后 4 小时。每组均检测 DFI、MMP、AR 三个项目。1.2 仪器与试剂 检测 DFI、MMP、AR 的试剂盒均购自浙江星博生物科技股份有限公司；流式细胞仪 Calibur 购自美国 BD公司；移液器为德国 Eppendorf 公司产品；普通光学显微镜为日本 Olympus 公司产品；恒温平板 O57 为澳大利亚 LEC 公司产品；DK-98-11A 恒温水浴箱为天津泰斯特仪器有限公司产品；超净工作台为 AIRTECH 公司产品。各种精液处理以及胚胎培养试剂均为瑞典Vitrolife 公司产品。1.3 精液采集及处理 男方禁欲 27d，以手淫法采集精液至无菌精液杯后，立即放置 37恒温平板上。待精液完全液化后，采用密度梯度离心法+上游孵育法对精液进行优化处理，将处理前后的精液进行相关功能的检测分析。吸取 200 微升待检测精液样本，经试剂盒固定染色后，使用流式细胞仪检测精子 DFI、MMP 以及 AR。所有操作均参照 WHO人类精液检查与处理实验室手册第 5版标准。所有单项操作均由同 1 人完成。1.4 统计学分析 采用 SPSS22.0 软件进行各组间 DFI、MMP 以及 AR的方差分析，多组间比较采用单因素方差分析。以=0.05（双侧）为检验水准，P0.05 时认为无差异，在 P0.05 时认为差异具有统计学意义。2 结果 中文科技期刊数据库（全文版）医药卫生-97-表 1 精液处理前后不同时间段精子功能的比较 DFI（S）MMP（S）AR（S）1 20.9305.559a 15.14413.973c 14.0503.633e 2 11.2802.203b 62.75221.219d 28.80811.486f 3 13.18610.108b 73.77613.060d 29.02210.109f 4 12.8127.197b 46.71234.940d 34.71212.931f 5 13.4347.303b 47.12436.487d 25.32414.121f 6 14.3387.095b 39.47242.452d 15.5907.572f 采用密度梯度离心法+上游孵育法优选精子，根据优选精液前后不同时间段分为 6 组，由下表可见，精液优化处理前后相互比较，两组 DFI 的 P0.05，表明DFI有显著差异；精液优选后4小时内DFI值分别比较，P0.05，表明 DFI 无显著差异。精液优选前后比较 MMP值，P0.05，表明有显著差异；精液优选后 4 小时内MMP 值分别比较，P0.05，表明无显著差异。精液优选前后比较 AR，P0.05，表明有显著差异；精液优选后4小时内AR值分别比较，P0.05，表明无显著差异。图 1 处理前 DFI 图 2 处理后 DFI 图 3 处理前 MMP 图 4 处理后 MMP 图 5 处理前 AR 图 6 处理后 AR 3 讨论 随着科技的发展，人类辅助生殖技术（ART）广泛应用于全球，为不孕不育夫妇带来了福音。近年来随着检验技术的不断发展，精子功能的检测也越来越受到重视，精子的质量对于保证受精正常发生，维持胚胎发育以及种植起着至关重要的作用，高质量的精子更有利于 ART 的妊娠结局。本实验通过采集五位精液浓度正常的 IVF 患者的精液标本，分别在优化处理前中文科技期刊数据库（全文版）医药卫生-98-以及优化处理后 4 小时内，对不同时间段的精子功能进行检测。主要探讨精液优选后 4 小时内，精子功能是否有显著改变，由此来推断最佳的体外授精时间。精子染色质的主要成分为核蛋白与 DNA，有研究表明，精子 DNA 损伤可导致精液质量降低，造成早期胚胎发育障碍、流产率升高和后代遗传缺陷发生几率提高等后果。亦有学者研究发现6-7，随着精子放置时间的加长，精子与精子培养基混悬液中的代谢产物会逐渐增加，受这些代谢产物的影响，精子的运动力则会逐渐减弱，如精子 DFI 也会有所增加。同时也有研究认为，DNA 损伤高的精子受精能力差，主要与卵子透明带的自然选择作用有关，即高 DFI 的精子被“自然”优胜劣汰了，由此得出 DFI 与人工授精成功率无关的结论。本研究通过对比优化处理前后 DFI 值的变化，可知，处理后 DFI 值小于处理前，P0.05，该差异具有统计学意义。Donnelly 等8对精液标本进行梯度离心处理后，也曾比较原精液和处理后样本精子 DNA 链的完整性，结果显示，优化处理后的精子 DNA 链完整性有显著性提高，与本实验结果相符。通过实验结果可知，处理后 4 小时内，DFI 值的改变不显著，推测有可能与精子染色质结构有关。哺乳动物的成熟精子 DNA是连接最紧密的，相比有丝分裂过程中的染色体 DNA，至少浓缩了 6 倍。鱼精蛋白完美的嵌合在 DNA 链的凹槽内，两条同样形成的 DNA 单链平行排列紧密缠绕，使得成熟精子的染色质结构相对稳定。因此，优化处理后，整体精子 DNA 链完整性得到提高，同时得益于精子染色质的相对稳定性，在短时间（4 小时）内不易继续发生更多的 DNA 损伤，因此处理后 4 小时内 DFI值无明显改变。作为体内生产能量的工厂，线粒体的功能主要为参与能量转化、氧化磷酸化（OxPHOS）、三羧酸循环以及储存钙离子。精子线粒体内产生的腺嘌呤核苷三磷酸，是精子活动所需能量的主要来源。因此，精子的线粒体功能状态对精子的活力有着直接影响，进而与男性不育产生一定的关联性。线粒体膜电位的高低有助于评估线粒体活性，膜电位的降低也预示着精子凋亡的开始。2002 年 Marchetti 描述了线粒体的能量状态通过 MMP 调节完整的功能性线粒体，并与精子的运动直接相关，通过测量精子细胞内线粒体膜电位（MMP）可以很容易地评估精子活力等9-10。周秀芬等11通过比较弱精症患者与正常人的线粒体膜电位发现，弱精症组线粒体膜电位与正常对照组相比明显降低，同时还发现线粒体膜电位的丧失率与精子早期凋亡率呈显著正相关性。吴佳学等12通过对不育男性以及正常生育男性的精子线粒体膜电位检测发现：不育男性组膜电位明显低于正常生育组，而线粒体膜电位与精子向前运动率以及正常精子形态率呈显著正相关性。因此，Piasecka 等人建议人类精子的 MMP 变化的检测是评估 IVF 成功的精子质量的重要指标13。通过实验结果可知，经优化处理后的精液 MMP 较处理前增高，并且具有显著差异。精子的正常顶体反应是正常哺乳动物受精的必要条件，因为只有发生顶体反应的精子才能穿过透明带与卵细胞膜融合完成受精，其发生已被反复证明是体外受精的重要预测因素14-15，而精子发生顶体反应能力出现异常的患者可能表现出较低的生育力16。国内学者梁嘉颖等通过诱发精子发生顶体反应，对妊娠组与非妊娠组的诱发顶体反应率进行比较，发现两组间存在显著差异，表明顶体反应的检测可预测精子的受精能力，有助于选择辅助生殖技术治疗方案。国内学者凌玲曾对人新鲜及冷冻精子，在不同孵育时间内及不同条件下，比较精子顶体反应的变化。她提出在诱发剂的作用下，大部分精子需要较长的孵育时间或和较高的诱发剂浓度。同时表明人精子最大顶体反应诱发率出现在体外孵育 6 小时之后17。本实验发现经优化处理后的精液标本，其顶体反应率在处理后 4 小时内并无明显改变，与前者结果相符。目前，对于体外受精胚胎移植（IVF-ET）治疗患者的体外授精时间，多在人绒毛膜促性腺激素（hCG）注射后 39-40 小时，此时大部分标本距离精液优化完成均超过 2 小时。根据相关报道得知诱发性 AR 与精子活力、精子正常形态成正相关，与 DFI 成负相关，提示诱发性 AR 高的患者，有较多正常形态的精子，较低的 DFI 值，受精能力较强18。本研究由实验结果可知，经密度梯度离心法+上游孵育法处理精液后，精子 DFI值明显降低，MMP 值明显升高，AR 值亦有改善，由此表明精液优选后可明显改善精子功能，提高精子质量。但是在精子处理后上游 4 小时内，精子功能无显著差异，由此可初步推断，在精液优化后 4 小时内进行体外授精，对 ART 的结局无明显差异。本研究对于取卵日中对取精时间的安排，以及体外授精时间的制定，具有初步指导意义。同时由于本次实验样本数较少，中文科技期刊数据库（全文版）医药卫生-99-具有一定的实验误差，在接下来的探索中，将会加大样本量，并对胚胎的受精率、卵裂率、优胚率以及临床妊娠率等进行进一步的研究。参考文献 1Li M W,Lloyd K.DNA fragmentation index(DFI)as a measure of sperm quality and fertility in miceJ.Sci Rep,2020,10(1):3833.2Uribe P,Villegas J V,Boguen R,et al.Use of the fluorescent dye tetramethylrhodamine methyl ester perchlorate for mitochondrial membrane potential assessment in human spermatozoaJ.Andrologia,2017,49(9).3Guo H,Gong Y,He B,et al.Relationships between mitochondrial DNA content,mitochondrial activity,and boar sperm motilityJ.Theriogenology,2017,87:276-283.4Pelliccione F,Micillo A,Cordeschi 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