基于药物重定位建立以α1酸性糖蛋白为靶点的高通量筛选平台及潜在减肥药物的发现.pdf
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1、 论著 基于药物重定位建立以 1 酸性糖蛋白为靶点的高通量筛选平台及潜在减肥药物的发现陈枫1,杨慈荣2,张圳1,陈飞1,刘霞1(1.海军军医大学药学系临床药学教研室,上海 200433;2.92730 部队 92 分队,海南 三亚 572000)摘要目的1 酸性糖蛋白(ORM)是减肥药物研发的新靶点。基于药物重定位,拟从已上市药物的化合物库中寻找可以靶向 ORM 的潜在减肥药物。方法构建 pGL4.20-ORM1 启动子重组质粒,验证后利用慢病毒载体构建稳定表达ORM1 启动子-LUC-PURO 的 AML12 细胞株,利用该细胞株对上市药物库中化合物进行高通量筛选,通过酶标仪对细胞的荧光值进
2、行表征。结果对 1 470 种化合物进行初筛和复筛,发现 42 种化合物可以提高 ORM1 启动子表达,可用于进一步的减肥效应评估。结论通过慢病毒载体成功构建了 LV-AML12-ORM1 启动子-LUC-PURO 稳定表达细胞株,为高效、稳定筛选靶向 ORM 的减肥药物奠定了基础。关键词 药物重定位;1 酸性糖蛋白;高通量筛选;肥胖;减肥药物文章编号 2097-2024(2024)03-0114-07DOI 10.12206/j.issn.2097-2024.202309057Establishment of a high-throughput screening platform base
3、d on drugrepurposing targeting alpha-1-acid glycoprotein and discovery of potentialweightlossdrugsCHEN Feng1,YANG Cirong2,ZHANG Zhen1,CHEN Fei1,LIU Xia1(1.School of Pharmacy,Naval Medical University,Shanghai200433,China;2.Unit 92,92730 Force,Sanya 572000,China)AbstractObjectiveAlpha-1-acid glycoprot
4、ein(ORM)was a new target for the development of weight loss drugs.Tosearch for potential weight loss drugs that could target ORM from the compound library of already marketed drugs based on drugrepurposing.MethodsThe pGL4.20-ORM1 promoter recombinant plasmid was contructed and validated,and then a l
5、entiviralvector was utilized to establish stable AML12 cell lines expressing ORM1 promoter-LUC-PURO.This cell line was employed forhigh-throughput screening of compounds from the marketed drug library,and the luminescence value of the cells was characterizedby enzyme marker.Results Primary screening
6、 and secondary screening of 1 470 compounds identified 42 compounds thatincreased ORM1 promoter expression and could be used for further weight loss effect assessment.Conclusion This studysuccessfully constructed LV-AML12-ORM1 promoter-LUC-PURO stable expression cell lines using lentiviral vectors,l
7、aying afoundation for efficient and stable screening of weight loss drugs targeting ORM.Keywords drug repurposing;ORM;high-throughput screening;obesity;weight loss drugs 0前言肥胖是一种慢性代谢性疾病,是指由于能量摄入超过消耗,导致体内脂肪积聚过多或分布异常而造成体重增加的一种疾病。肥胖会提高 2 型糖尿病、高血压、血脂异常、心血管疾病和某些癌症的发病率1-3,降低生活质量并增加死亡风险。减肥手术是最有效的减肥方法4,但手术有
8、潜在的风险和限制,且无法满足全球范围内患者的医疗需求。改善饮食结构、生活方式以及增加身体活动等短期行为干预也不足以达成长期减肥的目的5。因此,药物治疗是中、重度肥胖患者以及有并发症的轻度肥胖患者的首要治疗选择6。多年来,减肥药物有着坎坷曲折的研发历程,获批数量有限且许多已经上市的药物最终因心血管问题等不良反应而撤市,如盐酸氯卡色林(5-羟色胺 2C 受体激动剂)、西布曲明(抑制去甲肾上腺素和 5-羟色胺再摄取)等。因此,全球各大药物监管机构对减肥药物的批准一直非常严格。目前,全球共有 8 种上市的减肥药物,包括赛利司他(脂肪酶抑制剂)、奥利司他(脂肪酶抑制剂)、复方芬特 作者简介陈枫,硕士研究
9、生,Email:通信作者刘霞,教授,博士生导师,研究方向:心脑血管药理学,Email: 药学实践与服务2024 年 3 月 25 日第 42 卷第 3 期 114Journal of Pharmaceutical Practice and Service,Vol.42,No.3,March 25,2024 明-托吡酯(肾上腺素受体激动剂与-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异噁唑丙酸受体拮抗剂)、复方纳曲酮-安非他酮(肾上腺素吸收抑制剂与多巴胺摄取抑制剂)、二甲双胍(单磷酸腺苷活化蛋白激酶激动剂)、苄非他明(肾上腺素受体激动剂)以及最新批准的利拉鲁肽和司美格鲁肽(GLP-1 受体激动剂)。然而,这
10、些上市减肥药物的耐受性和安全性也受到挑战,如奥利司他会导致严重的脂肪泻;利拉鲁肽价格昂贵,存在恶心等胃肠道反应,不易推广。匮乏的减肥药物市场亟需基于新靶点的全新减肥药物以应对肥胖日益严峻的发病形势。ORM(Orosomucoid),也称为 1 酸性糖蛋白(AGP),是肝脏急性期反应蛋白7。ORM 在人体中有 2 种亚型(ORM1 和 ORM2),小鼠中有 3 个亚型(ORM1、ORM2 和 ORM3),大鼠中仅有 1 种型。在人和小鼠体内,ORM1 的组成水平远高于 ORM2(5 倍),并且只有 ORM1 可以被急性期刺激诱导。ORM 具有转运药物、调节免疫、维持毛细血管屏障等功能8。团队前期
11、研究发现,ORM 具有能量代谢的调节作用,循环中的 ORM 可以作用于下丘脑的瘦素受体,激活JAK2-STAT3 通路,抑制摄食、降低体重、改善胰岛素抵抗9。本团队进一步以 ORM为靶点,筛选到了一个靶向上调内源性 ORM 的全新小分子化合物 HMS-01,在瘦素缺陷的 ob/ob 肥胖小鼠和高脂喂食的肥胖小鼠上,均展示了良好的减肥效果,在国家重大新药创制资助下,已经进入到临床前研究阶段。这些研究均提示,ORM 是一个治疗肥胖的全新潜在靶点9,靶向上调内源性ORM 的小分子有可能发展为新型减肥药物。然而,新的减肥药物研发面临高投入、低回报的困境,传统新药研发需要消耗 1015 年的时间,以及约
12、 25 亿美元的投入,而达到期临床试验最后阶段的药物中有 50%最终无法被批准上市10,每一次失败都会消耗大量的时间与资源。药物重定位是一种药物发现和开发的策略,旨在重新评估已经开发或研究的药物,以寻找其在新的疾病领域或治疗应用中的潜在价值。该策略的目的是最大化已有药物的利用,降低新药开发的时间和成本。本研究利用基因重组技术构建了含有 ORM1 启动子上游 2 000 个碱基对序列的荧光素酶报告基因,由于 ORM 主要由肝脏合成,通过血液分泌至全身发挥作用,于是选用 AML12 小鼠正常肝细胞构建了稳定表达 LV-ORM1 启动子-LUC-PURO 的细胞株,从而建立了一个以 ORM 为靶点的
13、药物筛选平台和评价体系,用于高通量筛选上市药物库中靶向 ORM 的药物,为药物重定位发现潜在减肥药物奠定基础。1材料和方法 1.1 细胞及载体AML12 小鼠正常肝细胞、HEK-293T 上皮细胞、载体pGL4.20luc2/Puro 与pHBLV-CMV-MCS-EF1-puro、慢病毒包装辅助质粒 pMD2.G 和 psPAX2均为实验室保存;DH5 感受态细胞(天根生化科技有限公司);ORM1 启动子基因序列来自 NCBI 数据库(NC_000070.7)。1.2 主要仪器Veriti 96 孔快速热循环仪(Thermo FisherScientific 公司,美国);移液器、低温高速台
14、式离心机(EPPENDORF 公司,德国);电热恒温培养箱(上海跃进医疗器械有限公司);琼脂糖凝胶电泳仪、多功能水平电泳槽(上海天能科技有限公司);电热恒温水浴锅(上海一恒科技有限公司);倒置生物显微镜(重庆光电仪器总公司);全波长多功能酶标仪(BMG,德国)。1.3 主要试剂PCR 引物和基因合成(生工生物工程股份有限公司);RNA 提取试剂盒 RNAeasy动物 RNA 抽提试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司);限制性内切酶 KpnI、限制性内切酶 Hind、限制性内切酶 AgeI、限制性内切酶 ApaI、限制性内切酶 ClaI、限制性内切酶BamHI、转染试剂Lipofectamine
15、3 000试剂盒(Thermo Fisher Scientific 公司,美国);高保真聚合酶 phanta Max-Super-Fidlity DNA polymerase(南京诺唯赞生物科技股份有限公司);PCR 试剂盒 2X Pro Taq 预混液、反转录试剂盒 Evo M-MLV反转录试剂预混液、SYBR Green Pro Taq HS 预混型 qPCR 试剂盒(湖南艾科瑞生物工程有限公司);琼脂糖凝胶 DNA 纯化回收试剂盒、质粒小提试剂盒(天根生化科技有限公司);HB-infusionTM 无缝克隆试剂盒(汉恒生物科技有限公司);转染试剂polybrene(Sigma,美国);F
16、irefly-Glo 萤光素酶报告基因检测试剂盒(大连美仑生物技术有限公司);FDA 上市药物库(陶术生物科技有限公司);测序由赛业生物科技有限公司完成。1.4 基因组 RNA 提取提取小鼠新鲜的肝组织,使用 RNAeasy动物 RNA 抽提试剂盒提取总 RNA,反转录为 cDNA,用作 PCR 模板,保存于20 冰箱。药学实践与服务2024 年 3 月 25 日第 42 卷第 3 期 Journal of Pharmaceutical Practice and Service,Vol.42,No.3,March 25,2024115 1.5 ORM1 启动子目的基因的获得和扩增根据同源重组引
17、物设计原则和参考小鼠ORM1(NC_000070.7)基因组序列设计引物(选取起始位点上游 2 000 个碱基对),采用同源重组法设计引物,上游引物加入 KpnI 酶切位点,下游引物加入 Hind 酶切位点,引物序列见表 1。产物进行琼脂糖凝胶电泳,使用琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒回收目的基因。表1ORM1启动子基因引物序列 引物名称引物序列(53)ORM1-FGGGGTACCGTTCTCAGCATGTTGCATAAATORM1-RCCAAGCTTGCTGAGGGCACTCAGAGC注:F:正向引物;R:反向引物。1.6 报告基因质粒 pGL4.20-ORM1 启动子的构建及扩增将 PCR
18、产物与载体质粒 pGL4.20 luc2 Puro(插入位点选择 AgeI 与 ApaI)于 37 双酶切 5 h,用同源重组酶将目的片段与载体质粒连接。使用DH5 感受态细胞将重组质粒进行转化后,接种于含有嘌呤霉素抗性的固体平板,用涂布器将重组质粒涂抹均匀,倒置 37 恒温箱培养 1216 h。将筛选出来的阳性克隆进行测序,随后进行菌液扩增和质粒抽提纯化。对提取的质粒进行浓度检测和A260/280 检测,把质粒保存于20 冰箱。构建成功的重组载体命名为 pGL4.20-ORM1 启动子。根据 Lipofectamine 3 000 试剂盒说明书,分别将pGL4.20-ORM1 启动子和 pG
19、L4.20 转染至 AML12小鼠正常肝细胞中,使用地塞米松(DXMS)来验证报告基因的有效性和可行性。1.7 慢病毒表达载体LV-ORM1 启动子-LUC-PURO的构建及扩增以 pGL4.20-ORM1 启动子重组质粒为模板,设计引物,引物序列见表 2。产物进行琼脂糖凝胶电泳,使用琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒回收目的基因。表2LV-ORM1启动子-LUC-PURO 基因引物序列 引物名称引物序列(53)LV-ORM1启动子-LUC-PURO-FGGACAGCAGAGATCCAGTTTATCGATGTTCTCAGCATGTTGCATAAATTLV-ORM1启动子-LUC-PURO-RGAG
20、CGATCGCAGATCCTTAGGATCCTTACACGGCGATCTTGCCGCCCTT注:F:正向引物;R:反向引物。将 PCR 产物与载体质粒 pHBLV-CMV-MCS-EF1-PURO(插入位点选择 ClaI 与 BamHI)于 37 双酶切 5 h,用同源重组酶将目的片段与载体质粒连接。使用 DH5 感受态细胞将重组质粒进行转化后,接种于含有嘌呤霉素抗性的固体平板,用涂布器将重组质粒涂抹均匀,倒置 37 恒温箱培养1216 h。将筛选出来的阳性克隆,送赛业生物科技有限公司进行测序。测序成功之后,进行菌液扩增和质粒抽提纯化。对提取的质粒进行浓度检测和 A260/280 检测,把质粒
21、保存于20 冰箱。构建成功的重组载体命名为 LV-ORM1 启动子-LUC-PURO。同样方法构建 LV-LUC-PURO 作为对照载体。1.8 慢病毒包装及浓缩纯化及滴度检测 1.8.1 包装提前传代 HEK-293T 细胞用于转染,将慢病毒包 装 辅 助 质 粒 pMD2.G 10 g、psPAX2 5 g和 LV-ORM1 启动子-LUC-PURO 10 g 以及转染试剂 75 l 混匀后静置,在室温下温育 15 min 后缓慢滴加至 293T 细胞中,于 37、5%CO2细胞培养箱中培养。转染后16 h 更换含10%胎牛血清 FBS的新鲜完全培养基。转染后 48 h 和 72 h,分别
22、收集两次病毒上清液(48 h 收集后置换新鲜完全培养基),将两次收集的上清液混合,进行离心浓缩和病毒管分装,80C 冰箱保存。1.8.2 病毒滴度检测将生长状态良好的 HEK-293T 细胞消化计数后稀释至 1105个/ml,加入 96 孔板,100 l/孔,为每个病毒准备 6 个孔。放入 37C、5%CO2 培养箱中培养。将病毒进行 3 倍梯度稀释,共 6 个稀释度,接种于 293T 细胞,继续培养 48 h 后,在荧光显微镜下观察结果。在观察结果前 6 h 需更换新鲜10%FBS 完全培养基,从孔中吸出 80 l 培养基,然后加入 80 l 新鲜 10%FBS 完全培养基,放入 37C、5
23、%CO2 培养箱中培养。6 h 后荧光显微镜下观察结果,荧光或活细胞百分比在 10%50%的孔计算病毒滴度。目的病毒命名为 LV-ORM1 启动子-LUC-PURO。同样方法,阴性对照病毒命名为 LV-LUC-PURO。1.9 LV-AML12-ORM1 启动子-LUC-PURO 稳转细胞株的筛选及建立将 AML12 小鼠正常肝细胞在含有 10%FBS、1%ITS(10 g/ml 胰岛素+5.5 g/l 转铁蛋白+5 ng/ml硒)、1%双抗以及 40 ng/ml DXMS 的 DMEM 培养基,于 37、5%CO2饱和湿度的细胞培养箱内培养。AML12 细胞在 10 cm 培养皿中细胞长满以
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