实验计划书.doc
《实验计划书.doc》由会员分享,可在线阅读,更多相关《实验计划书.doc(8页珍藏版)》请在咨信网上搜索。
1、 实验计划书(初定) xxxxxxx年xx月xx号此为初步计划书,还有很多不成熟甚至错误之处,望老师给予指出!I 总体计划本实验总体上分为三大步.(1)生理实验部分:本部分主要进行papaya硬度和细胞壁相关酶类活性的测定。(2)分子实验部分:本部分主要是获得papaya细胞壁相关酶类的基因序列以及由RNA差异表达谱获得细胞壁代谢酶基因等的表达特征.(3)验证实验部分:本部分主要通过实时荧光定量PCR的方法(Real time QPCR)验证并初步确定与“橡皮化”相关的细胞壁代谢酶基因的家族成员. 生理实验部分是第一步需要实施的,也是比较独立的部分,初步定为40天左右的时间结束.分子实验和验证
2、实验部分是本实验的核心,这两部分紧密结合,需要同步进行,首先是各种样本(CK,ETH,1MCP)的获得,随后是各样本的RNA提取,然后委托深圳华大基因公司进行转录组测序并从转录组中筛选细胞壁代谢相关的基因序列,采用5RACE及3RACE的方法,获得这些基因的全长序列以及构建差异表达谱进行相关差异基因筛选等生物信息分析,最后通过实时荧光定量PCR的方法(Real time QPCR)验证并初步确定与“橡皮化”相关的细胞壁代谢酶基因的家族成员。II 详细计划一,买果。二,采后预处理:采后立即运回实验室,剔除病果和机械损伤果,选用形状、大小、外观颜色相对一致的番木瓜果实,剪留0。5cm长果柄为实验材
3、料。先用1。0 g/L的次氯酸钠溶液洗果10 min,再用0。5g/L的施保功溶液浸泡果实10 min,取出晾干后备用。三,样品分组(四组): 1。对照组:果实用PE(聚乙烯)保鲜袋包装,轻绑袋口,置于低温(15)的恒温箱中贮藏。2.1。0l/L的1MCP处理(橡皮化果实):在室温条件下(25),用浓度1.0l/L的1MCP密闭熏蒸处理果实24 h,取出果实后用PE保鲜袋包装,轻绑袋口,置于15(冷藏)、RH(相对湿度)为90%的条件下贮藏。 3.0.5 g/L的乙烯利处理:在室温条件下(25),用浓度0。5 g/L的乙烯利处理果实3分钟,取出果实后用PE保鲜袋包装,轻绑袋口,置于15(冷藏)
4、、RH为90的条件下贮藏。四,实验过程:贮藏过程中每隔2d(催熟果实)和5d取样一次,鲜果或-70贮存,为以后进行基因表达水平的研究.取样的同时,进行以下生理指标的测定: 1。果实硬度: 使用果实硬度计(FHM-1型,日本产)进行测定。 2。PG(多聚半乳糖醛酸酶)活性:称取1g果肉,加入5mL(先加3 mL,后用2mL冲洗) 0。05mol/L,pH4。6的柠檬酸缓冲液低温存放(含5%NaCl和1。8 mM的EDTA(乙二胺四乙酸)),冰浴研磨匀浆。然后在10000转离心30min,将上清液进行透析,用0.05mol/L,pH4。6的柠檬酸缓冲液作为透析液,透析液不含EDTA和NaCl。透析
5、条件:4条件下放24小时,中间换一次缓析液,透析完的溶液用于酶活力的测定。该操作在冰浴下进行。PG活性测定:PG 活性测定以1 多聚半乳糖醛酸 (PGA , 美国Sigma 公司) 为底物, 反应混合液为:1 PGA0。5 mL、醋酸钠缓冲液(pH 4。6)1。5 mL、酶提取液0。5 mL, 0。5 mL的水(总反应体系为3mL), 40 反应60 min, 立即加入1mLDNS (3, 5二硝基水杨酸)终止反应.再加入沸水中煮沸10 min 后冷却,于波长540 nm 下定量分析酶水解生成的半乳糖醛酸含量.以3mL蒸馏水+1 mLDNS作为对照(CK)。以每小时释放1mg 的D半乳糖醛酸(
6、美国Sigma 公司) 为1 个酶活性单位(U)。以标准D半乳糖醛酸绘制标准曲线。试验重复3 次。对照不加酶液,以缓冲液代替。 3。PME(果胶甲酯酶)酶活性:取2g果肉,加3mL 预冷的1 mol/L NaCl 和2 g PVP(聚乙烯基吡咯烷酮)置于研钵中,充分研磨后,转移到离心管中,再用2mL NaCl润洗,倒入离心管中,于冰浴中放置1小时,每隔20 min震荡一次,在4下,10000转离心30 min,收集上清液,用0。01 mol/L NaOH调至pH为7.5, 于4保存备用。测定:在试管中依次加入1。5mL 0.5% (w/v)的果胶放冰箱备用,有效期5天、0。5 mL0.01溴麝
7、香酚兰指示剂棕色瓶(pH为7。5),1。0 mL水,0。5 mL酶液(酶液最后加入),总反应体系为3.5 mL .立即将试管放入37的水浴锅中30 min,以蒸馏水为CK。取出试管后冷却,迅速测定其在620 nm波长一分钟内的变化.以每min变化0.01为一个活力单位(U),以U/ g.FW表示。 4.纤维素酶(CX):取0。625g羧甲基纤维素钠溶于0.2 mol/L(pH为4。6)的醋酸钠缓冲液中,加几滴氢氧化钠调PH值到7。0,放低温下溶解,定容至100 mL。酶液的制备同PG。活性测定:反应体系为1 mL CMC(羧甲基纤维素钠)溶液,酶液1 mL,醋酸钠缓冲液(pH 4。6)1。0
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 实验 计划书
1、咨信平台为文档C2C交易模式,即用户上传的文档直接被用户下载,收益归上传人(含作者)所有;本站仅是提供信息存储空间和展示预览,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对上载内容不做任何修改或编辑。所展示的作品文档包括内容和图片全部来源于网络用户和作者上传投稿,我们不确定上传用户享有完全著作权,根据《信息网络传播权保护条例》,如果侵犯了您的版权、权益或隐私,请联系我们,核实后会尽快下架及时删除,并可随时和客服了解处理情况,尊重保护知识产权我们共同努力。
2、文档的总页数、文档格式和文档大小以系统显示为准(内容中显示的页数不一定正确),网站客服只以系统显示的页数、文件格式、文档大小作为仲裁依据,平台无法对文档的真实性、完整性、权威性、准确性、专业性及其观点立场做任何保证或承诺,下载前须认真查看,确认无误后再购买,务必慎重购买;若有违法违纪将进行移交司法处理,若涉侵权平台将进行基本处罚并下架。
3、本站所有内容均由用户上传,付费前请自行鉴别,如您付费,意味着您已接受本站规则且自行承担风险,本站不进行额外附加服务,虚拟产品一经售出概不退款(未进行购买下载可退充值款),文档一经付费(服务费)、不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
4、如你看到网页展示的文档有www.zixin.com.cn水印,是因预览和防盗链等技术需要对页面进行转换压缩成图而已,我们并不对上传的文档进行任何编辑或修改,文档下载后都不会有水印标识(原文档上传前个别存留的除外),下载后原文更清晰;试题试卷类文档,如果标题没有明确说明有答案则都视为没有答案,请知晓;PPT和DOC文档可被视为“模板”,允许上传人保留章节、目录结构的情况下删减部份的内容;PDF文档不管是原文档转换或图片扫描而得,本站不作要求视为允许,下载前自行私信或留言给上传者【丰****】。
5、本文档所展示的图片、画像、字体、音乐的版权可能需版权方额外授权,请谨慎使用;网站提供的党政主题相关内容(国旗、国徽、党徽--等)目的在于配合国家政策宣传,仅限个人学习分享使用,禁止用于任何广告和商用目的。
6、文档遇到问题,请及时私信或留言给本站上传会员【丰****】,需本站解决可联系【 微信客服】、【 QQ客服】,若有其他问题请点击或扫码反馈【 服务填表】;文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“【 版权申诉】”(推荐),意见反馈和侵权处理邮箱:1219186828@qq.com;也可以拔打客服电话:4008-655-100;投诉/维权电话:4009-655-100。