定量PCR加样操作流程.doc

QPS201加样流程和Step One Plus仪器的仪器操作要准备的东西:1. 八排管和盖子2. 96孔细胞培养板3. 移液器：10ul，20ul，100ul，200ul。4. 枪头10ul，20ul，100ul，200ul或者300ul.5. 200ul和600ul的PCR管.6. 试剂：QPk201，上下游引物，cDNA，去RNA酶的PCR水7. 注意事项：A。引物的储存浓度100nm，工作浓度:510nmol,引物要过量,上下游引物要先混匀在一起，然后再加.内参actin和目标基因的引物都要混匀.混匀后的引物可用半个月，用时要反复混匀，水样的东西混20下,油状的(酶）东西至少要混30下.B.试剂配总管用，cDNA和酶mix配一管，引物和水配一管。混匀之后，再分别加到管子里。为什么试剂要配总管呢?cDNA模板量很少，所以加多加少对实验影响很大,酶加10ul，样多，少量的东西要想混匀,必须放在大量的东西里这样再去混匀，就可以使每个管子里的样品都能保证是一致的。C。内参和目标基因都要跑3个复孔，取平均值，差异CT值要在0。5之内,如果Ct值0.5，结果就不可信,要重新再做.（一） QPk-201加样流程:用QPk201做样品体系是20ul的.cDNA ：2ulPCR水：6ul上下游引物共:2ul酶MIX：10ul一共是20ul体系。把cDNA ：2ul和酶mix：10ul共12ul配一管.把引物：2ul和水6ul共8ul配一管。以下以样品为例，加样流程如下：目标基因STOB1，样品六个，编号：1,2,3，C5，C6,C7内参基因actin样品123C5C6C7目标基因STOB1STOB1STOB1内参ActionActionAction如何计算是关键：6个样品，每个样品配一管，再分6次加，但是要考虑都损失，所以要多加10%的量，以避免最后没得加了。cDNA和酶配一管：cDNA:261。1=13.2ul酶Mix:1061。1=66ul，在总管里吹打30次混匀,取12ul。引物和水配一管：引物：2181.1=39。6ulPCR水：6181。1=118。8ul,在总管里吹打20次混匀，取8ul。配完之后要混匀.剩下的就是加样，贴在一侧的壁上，加样时，先吹打，再吸，贴壁打到底，按着不松，把移液器收回来。加一个样品,就换一个枪头。加另一管的时候,把管子反过来,再在这一侧壁上加管,的就不用换枪头了。这个加样的步骤一般是在碎冰上操作的，试剂一定要放在冰上的。加完之后，轻轻的盖上盖子,放在离心机里离心，让试剂都落到管子底部去。离心完之后,就可以放到定量PCR仪的黑色的96孔板子上了,然后打开机器，放进去，开始设置了。