生物样品预处理.ppt
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1、生物样品预处理的常用方法以及最新进展常用的处理方法常用的处理方法 处理方法简介处理方法简介 4生物样品预处理的目的生物样品预处理的目的 1预处理的指导原则预处理的指导原则23目录一、生物样品一、生物样品 生物样品的种类生物样品的种类生物样品血液尿液其他头发唾液组织器官胆汁、乳汁、脑脊液、泪液、精液、胃液、胰液、淋巴液、粪便等。一、生物样品预处理的目的一、生物样品预处理的目的1.1.使药物从缀合物及结合物中释放出来,以测定药物的使药物从缀合物及结合物中释放出来,以测定药物的 总浓度。总浓度。2.2.生物样品介质组成复杂,干扰多,而药物组分是微量生物样品介质组成复杂,干扰多,而药物组分是微量 的,
2、必须先经过预处理,使纯化,富集。的,必须先经过预处理,使纯化,富集。3.3.为了适应和符合测定方法所要求的灵敏度。为了适应和符合测定方法所要求的灵敏度。4.4.为了防止分析仪器的污染、劣化,提高测定灵敏度、为了防止分析仪器的污染、劣化,提高测定灵敏度、准确度、精密度和选择性等。准确度、精密度和选择性等。二、生物样品预处理的指导原则二、生物样品预处理的指导原则生物样品进行预处理时应考虑到的问题:生物样品进行预处理时应考虑到的问题:1.药物的理化性质和存在性质 2.待测药物的浓度 3.药物测定的目的 4.选用的生物样品类型 5.样品预处理与分析技术的关系二、指导原则二、指导原则-预处理应考虑问题预
3、处理应考虑问题 1.药物的理化性质和存在形式 A.酸碱性质、未电离分子的亲脂性、挥发性:涉及药物 的提取性质、是否挥发损失以及能否采用GC法 a.较亲脂的药物:可用溶剂萃取,也可用烷基键和相 硅胶、大孔吸附树脂及亲水型填料SPE等方法。b.亲水性较强且有酸碱性、可电离药物:离子交换柱 和离子对液液萃取等。c.亲水性较强但不能电离药物:沉淀蛋白二、指导原则二、指导原则-预处理应考虑问题预处理应考虑问题 1.药物的理化性质和存在形式 B.药物在体内的存在形式及蛋白结合率:a.结合蛋白率高:首先去蛋白 b.多为代谢缀合物:缀合物水解 C.药物的光谱特性及官能团特性:涉及分析仪器 的选择以及是否需要衍
4、生化和特殊检测器。紫外吸收强弱:是否用UV检测器 含有-NO2、-Cl等电负性基团:ECD检测器二、指导原则二、指导原则-预处理应考虑问题预处理应考虑问题 1.药物的理化性质和存在形式 D.药物的稳定性:a.易氧化药物:加入抗氧剂 b.易被光分解药物:避光 c.易被酯酶水解药物:对酶进行灭活二、指导原则二、指导原则-预处理应考虑问题预处理应考虑问题 2.2.待测药物的浓度待测药物的浓度 浓度越大,预处理要求越低;反之,浓度越小,预处理要求越高。例如,地高辛的治疗血药浓度 为1-2ng/ml,而水杨酸的治疗血药浓度为20-100g/ml。3.3.药物测定的目的药物测定的目的 a.急性中毒病例:快
5、速鉴定所怀疑的药物,尽 可能短时间测得。预处理可粗放些。b.分别获得酸性、中性或碱性代谢物:要考虑 全面、细致二、指导原则二、指导原则-预处理应考虑问题预处理应考虑问题 4.4.选用的生物样品类型选用的生物样品类型血浆、血清:除蛋白然后提取唾液:离心去粘蛋白尿液:酸水解或酶水解法使缀合物水解头发:有机破坏 5.5.样品预处理与分析技术的关系样品预处理与分析技术的关系 样品预处理需要的净化程度与所用分析 方法是否专属、是否具有分离能力、检 测系统对杂质污染的耐受程度有关。三、常用的处理方法三、常用的处理方法常用方法常用方法1.有机破坏法有机破坏法2.除蛋白法除蛋白法3.缀合物的水解缀合物的水解4
6、.分离,纯化分离,纯化 与浓集与浓集5.衍生化法衍生化法重点介绍重点介绍除蛋白法除蛋白法 液液萃取法液液萃取法三、常用的处理方法三、常用的处理方法-有机破坏法有机破坏法 1.1.有机破坏法有机破坏法分分 类类特特 点点样样 品品湿法湿法破坏破坏硝酸 高氯酸法1、硫酸作为分解剂(消化剂),加氧化剂(硝酸、高氯酸、过氧化氢等)作辅助分解剂。2、破坏能力强,反应比较激烈,操作时,应在通风橱内进行。3、先低温反应,再高温蒸发,以免发生爆炸;4、所得的无机金属离子,一般为高价态。血、尿、组织电热消化器法人发电热板消化法烘箱消化法干法干法破坏破坏高温炽灼法1、适用于卤素、硒、硫、磷等微量元素分析的前处理
7、2、高温炽灼法:坩埚,先完全炭化,再灰化,盐酸溶解定容。盐酸加无水碳酸钠或氧化镁等以助灰化。(高温电子炉、低温等离子)3、氧瓶燃烧法:密闭的燃烧瓶中进行燃烧,选择适当吸收液。氧瓶燃烧法血、人发三、常用的处理方法三、常用的处理方法-除蛋白法除蛋白法蛋白质蛋白质沉淀沉淀酶解法酶解法去除蛋白去除蛋白三、常用的处理方法三、常用的处理方法-除蛋白法除蛋白法 1.蛋白质沉淀 蛋白质分子凝聚从溶液中析出的现象称为 蛋白质沉淀(precipitation),变性蛋白质 一般易于沉淀,但也可不变性而使蛋白质 沉淀,在一定的条件下,变性的蛋白质也可 不发生沉淀。表面水化层 调节pH至等电点蛋白质亲水胶体颗粒 凝集
8、析出 表面电荷 加入脱水剂破坏破坏三、常用的处理方法三、常用的处理方法-除蛋白法除蛋白法 测定血样时,首先应去除蛋白质。去除蛋白质作用:a.可使结合型药物释放出来,以便 测定药物的总浓度;b.可预防提取过程中蛋白质发泡,减少乳化的形成;c.可保护仪器性能(如保护 HPLC柱 不被污染),延长使用期限。三、常用的处理方法三、常用的处理方法-除蛋白法除蛋白法1.蛋白质沉淀方法 溶剂解法 盐析和脱水 加入中性盐蛋白质沉淀 加入强酸 生成不溶性盐沉淀 加入重金属沉淀剂三、常用的处理方法三、常用的处理方法-除蛋白法除蛋白法A.溶剂解法-加入与水相混溶的有机溶剂 加入水溶性的有机溶剂,可使蛋白质分子内及分
9、子 间的氢键发生变化而使蛋白质凝聚,使与蛋白质结 合的药物释放出来。常用的水溶性有机溶剂有:乙腈、甲醇、乙醇、丙 醇、丙酮、四氢呋喃等。含药物的血浆或血清与水 溶性有机溶剂的体积比为1:(13)时,就可以将 90以上的蛋白质除去。水溶性有机溶剂的种类不 同时,析出的蛋白质形状亦不同;并且所得上清液 的pH值也稍有差别,如用乙腈或甲醇时,上清液pH 为8.59.5,用乙醇或丙酮时,上清液pH为910。三、常用的处理方法三、常用的处理方法-除蛋白法除蛋白法A.溶剂解法-加入与水相混溶的有机溶剂 操作步骤:a.水溶性有机溶剂与血浆或血清按一定比例混合 b.离心分离,采用超速离心机(10000rmin
10、)离 心12min。(使用具塞塑料尖底管)c.取上清液作为样品。将蛋白质粘牢在管底,便于吸取上清液三、常用的处理方法三、常用的处理方法-除蛋白法除蛋白法A.溶剂解法-加入与水相混溶的有机溶剂 优点:1)分辨能力比盐析法高,即蛋白质或其它溶剂 只在一个比较窄的有机溶剂浓度下沉淀;2)沉淀不用脱盐,过滤较为容易;3)在生化制备中应用比盐析法广泛。缺点:对具有生物活性的大分子容易引起变性失活,操作要求在低温下进行。总体来说,蛋白质和 酶的有机溶剂沉淀法不如盐析法普遍。三、常用的处理方法三、常用的处理方法-除蛋白法除蛋白法B.加入中性盐 加入中性盐,使溶液的离子强度发生变化。中性盐 能将与蛋白质水合的
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