消风止痒颗粒通过降低白三烯水平对小鼠特应性皮炎急性瘙痒的治疗作用研究 (1).pdf
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1、 论著 消风止痒颗粒通过降低白三烯水平对小鼠特应性皮炎急性瘙痒的治疗作用研究丁华敏1,郭羽晨1,2,秦春霞1,宋志兵2,孙莉莉1(1.上海市浦东新区浦南医院,上海 200125;2.安徽中医药大学药学院,安徽 合肥 230012)摘要目的建立小鼠特应性皮炎急性瘙痒模型,研究消风止痒颗粒的止痒作用及其机制探讨。方法采用诱导法制备特应性皮炎小鼠模型。小鼠每天先后用卡泊三醇和卵清蛋白(OVA)涂抹右耳致敏 10 d,然后在小鼠右颊皮内注射OVA 进行激发,致使小鼠出现急性瘙痒,记录小鼠激发后 3060 min 的抓挠次数。实验分为 5 组:空白对照组、模型组、消风止痒颗粒低剂量组(7.2 g/kg)
2、和高剂量组(14.4 g/kg)、阳性对照组(孟鲁司特 5 mg/kg)。各组于激发前 12 h 及 30 min 各灌胃给药一次。通过 Elisa 检测小鼠血清中白三烯水平,通过流式细胞术检测血液中嗜碱性粒细胞比例及激活状态。结果小鼠经致敏和激发后出现明显的抓挠行为,模型组小鼠激发后 3060 min 内抓挠次数均值为 56 次,消风止痒颗粒低和高剂量组小鼠抓挠次数均值分别为 42 次和 23 次,较模型组均显著降低(P0.05)。消风止痒颗粒低、高剂量组血清中白三烯水平和嗜碱性粒细胞比例与模型组比较,均明显降低(P0.05)。结论消风止痒颗粒对小鼠特应性皮炎急性瘙痒具有一定治疗作用,作用机
3、制与其降低特应性皮炎小鼠血清中白三烯水平和降低嗜碱性粒细胞比例有关。关键词 消风止痒颗粒;特应性皮炎;瘙痒;嗜碱性粒细胞;白三烯文章编号 2097-2024(2024)05-0211-06DOI 10.12206/j.issn.2097-2024.202306031TherapeuticeffectofXiaofengZhiyanggranulesonacuteitchinginmicewithatopicdermatitisbydecreasingleukotrieneDING Huamin1,GUO Yuchen1,2,QIN Chunxia1,SONG Zhibing2,SUN Lili
4、1(1.Punan Hospital of Pudong New Area,Shanghai200125,China;2.School of Pharmacy,Anhui University of Traditional Chinese Medicine,Hefei 230012,China)AbstractObjectiveTo establish a mice model of atopic dermatitis with acute itching and investigate the antipruriticeffect and its mechanism of Xiaofeng
5、Zhiyang granules(XFZYG).MethodsA mice model of atopic dermatitis was prepared byinduction method.Mice were sensitized by calcipotriol and ovalbumin(OVA)applying to the right ear daily for 10 days,and thenstimulated by OVA injected intradermally into the right cheek to resulting in acute itching.Thes
6、e mice were divided into 5 groups:blank control group,model group,low dose (7.2 g/kg)and high dose (14.4 g/kg)of XFZYG,and positive control group(montelukast 5 mg/kg).Drugs were administered by gavage at 12 h and 30 min before stimulation.The leukotriene levels in theserum of the mice were measured
7、by Elisa and the basophil ratio and activation status in the blood were measured by flowcytometry.ResultsThe mean number of scratches in the model group was 56 between 30 min and 60 min after stimulation,whilethe mean number of scratches in the low and high dose of XFZYG groups were 42 and 23 respec
8、tively,which were significantlylower than those in the model group(P0.05).The serum leukotriene levels and the proportion of basophils in the low and highdose of XFZYG groups were significantly lower than those in the model group (P0.05).Conclusion XFZYG had certaintherapeutic effect on acute itchin
9、g of atopic dermatitis in mice,and the mechanism of its action was related to the reduction ofleukotriene level and basophil ratio in serum of mice with atopic dermatitis.Keywords Xiaofeng Zhiyang granule;atopic dermatitis;pruritus;basophil;leukotriene特应性皮炎(AD)是一种慢性、复发性、炎症性皮肤病,在全球疾病负担研究(GBD)中以伤残调整寿命
10、年的率衡量时,其造成的疾病负担在非致命性疾病中居于第 15 位,在所有疾病和损伤中居于59 位1,同时 AD 造成的负担还与一个国家的国内生产总值呈正相关2。在过去的几十年里,亚洲国家居民的 AD 患病率持续上升,AD 亦成为中国当前严重的公共卫生问题之一。中国居民 AD 的发 基金项目上海市浦东新区卫生系统优秀青年医学人才培养计划资助(PWRq2020-25)作者简介丁华敏,主管药师,研究方向:中药药理学,临床药学,Email:通信作者孙莉莉,副主任药师,研究方向:临床药学,Tel:13611615784,Email: 药学实践与服务2024 年 5 月 25 日第 42 卷第 5 期 Jo
11、urnal of Pharmaceutical Practice and Service,Vol.42,No.5,May 25,2024211 病率逐年增加,儿童和老年人在亚洲五国均具有较高的 AD 发病风险,且中国居民的 AD 发病风险随时期的推进而加重3。消风止痒颗粒现行质量标准收载于部颁标准中药成方制剂第十五册,标准编号:WS3-B-2975-98,处方中包括防风、蝉蜕、地骨皮、苍术(炒)、亚麻子、当归、地黄、木通、荆芥、石膏和甘草十一味药材4。消风止痒颗粒不仅对接触性荨麻疹作用明显,有缓解皮肤红肿,抑制风团之效5,还能改善尿毒症患者皮肤瘙痒症状6。本研究旨在通过消风止痒颗粒对 AD 引
12、起的急性瘙痒的缓解作用,探究其可能的作用机制,为中药在止痒方面的研究提供一定的基础和参考依据。1实验材料 1.1 实验动物健康 C57BL/6 小鼠 60 只,雄性,体重 1820 g,SPF 级,购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司,实验动物生产许可证号:SCXK(沪)2018-0006。饲养条件:室温 2025,湿度 40%70%,标准饲料,动物自由饮食和饮水。1.2 药物与试剂消风止痒颗粒由烟台东诚大洋制药有限公司提供,批号:Z20113054,规格:每袋 3 g,临用前用纯净水配制成所需浓度。卡泊三醇(aladdin,批号:C126438);卵 清 蛋 白(OVA,SAITONC,批
13、号:A80003);无水乙醇(aladdin,批号:E111991);小鼠白三烯 C4(LTC4)Elisa 试剂盒(江苏晶美生物科技有限公司,批号:JM-02678M1);红细胞裂解液(BD,Cat:555899);FITC 抗 小 鼠 FcRI 抗 体(BioLegend,Cat:134305);PE 抗小鼠 IgE 抗体(BioLegend,Cat:406907);PerCP/Cyanine5.5 抗小鼠 CD49b 抗体(Bio Legend,Cat:103519);APC 抗小 鼠 CD200R(OX2R)抗 体(BioLegend,Cat:123915)。1.3 仪器与设备JA20
14、03A 型电子天平(上海精天电子仪器有限公司);A51119500C 型全自动酶标仪(美国 Thermo科技公司);5 420 型高速离心机(美国 Eppendorf 公司);CytoFLEX 型流式细胞仪(美国贝克曼公司)。2实验方法 2.1 小鼠 AD 急性瘙痒模型建立参照 Wang 等的小鼠 AD 急性瘙痒模型制备方法7。8 周龄的 C57 小鼠,每天先用卡泊三醇(0.5 nmol,溶在 15 l 的 100%乙醇中)涂抹右侧耳皮肤(右耳内外侧各 7.5 l),然后用卵清蛋白(OVA,5 mg/ml,溶在 20 l 磷酸盐缓冲盐水 PBS中)进行涂抹(右耳内外侧各 10 l),连续处理
15、10 d(从第 0 天到第 9 天)以使小鼠敏感。对照组小鼠先用 15 l 乙醇处理,然后用 20 l PBS 处理。在第 10 天,在小鼠右颊皮内注射 OVA(2.5 mg/ml,溶在生理盐水中)20 l 进行激发。2.2 分组给药60 只雄性 C57BL/6 小鼠随机分为空白对照组、模型组、消风止痒颗粒低(7.2 g/kg)和高剂量组(14.4 g/kg)、阳性对照组(孟鲁司特,5 mg/kg)5 组,每组 12 只,适应性饲养 1 周后开始进行造模。消风止痒颗组低剂量是按体表面积换算方法由人临床使用剂量(15 岁以上患者 1 日分 23 次口服 36 g,按 60 kg 体重计算,即 0
16、.6 g/(kgd))换算成小鼠剂量(7.2 g/kg),高剂量设为低剂量的2 倍,即14.4 g/kg。各组小鼠给药途径均为灌胃给药,各组药物均在给药前现配。消风止痒颗粒低剂量组药物加饮用水后配成 1 g/ml 浓度,消风止痒颗粒高剂量组药物加饮用水后配成 2 g/ml 浓度;阳性对照组孟鲁司特加饮用水后配成 0.695 mg/ml 浓度,空白对照组用饮用水灌胃,各组小鼠均按 7.2 ml/kg 体积灌胃给药。各组于激发前 12 h 及激发前 30 min 各灌胃给药一次。2.3 观察指标 2.3.1 小鼠瘙痒行为学实验瘙痒行为在第 10 天上午 8 点至 11 点之间进行。测试前 2 d
17、将右侧脸颊备皮,测试前 1 d(即第9 天)将动物在测试室中适应 60 min。测试当天 给 药 30 min 后 在 小 鼠 右 颊 皮 内 注 射 OVA(2.5 mg/ml,溶在 0.9%生理盐水中)20 l 进行激发,录像 60 min,记数 3060 min 小鼠抓挠次数。抓挠的定义是前脚或后脚直接对背部、脸颊或耳朵进行连续抓挠的情况,当这种情况在鼠将前爪或后爪离开或放在嘴巴为计数 1 次。2.3.2 Elisa 检测小鼠血清中白三烯含量在小鼠瘙痒行为学实验结束后,每组随机取6 只小鼠进行眼眶取血,在离心管中 4 静置 2 h后,3 000 r/min 离心 10 min,取上清液到
18、新的离心管中备用。血清样本按 Elisa 试剂盒操作说明书进行实验。2.3.3 流式细胞术检测小鼠血液中嗜碱性粒细胞外周血淋巴细胞样本制备:每组各取 3 只小鼠,腹主动脉取血于抗凝管中(500 l 左右),每个 药学实践与服务2024 年 5 月 25 日第 42 卷第 5 期 212Journal of Pharmaceutical Practice and Service,Vol.42,No.5,May 25,2024 样品加入 1 ml 红细胞裂解液,室温孵育 15 min,1 000 r/min 离心5 min,弃去上清液,再次加入1 ml 红细胞裂解液,室温孵育 15 min,1 0
19、00 r/min 离心 5 min,弃去上清液后加入 1 ml PBS 重悬离心,得到外周血淋巴细胞。抗体孵育:各样品管外周血淋巴细胞用 300 l 的 PBS 重悬,每管加入 1 l 抗体,4 孵育 30 min,流式细胞仪进样检测。2.4 统计学方法 x实验数据以均值标准差(s)表示,采用GraphPad Prism 软件进行统计处理,采用单因素方差分析(one-way ANOVA)进行差异的显著性检验。P0.05 为差异具有统计学意义。3实验结果 3.1 消风止痒颗粒对小鼠急性瘙痒抓挠次数的影响空白对照组小鼠无明显的急性抓挠行为,模型组小鼠激发后出现明显的抓挠行为,模型组抓挠次数均值为
20、56 次,与模型组相比,各给药组均不同程度显著减少小鼠抓挠次数(P0.05),阳性对照组为34 次、消风止痒颗粒低剂量组为 42 次、消风止痒颗粒高剂量组为 23 次,结果见图 1。消风止痒颗粒能明显减少小鼠抓挠次数,改善小鼠 AD 急性瘙痒症状。120100806040200*空白对照组模型组阳性对照组消风止痒颗粒低剂量组消风止痒颗粒高剂量组抓挠次数(次/30 min)x图 1小鼠激发后 3060min 内的抓挠次数(n=10,s)*P0.05,*P0.01,*P0.001,与模型组比较。3.2 消风止痒颗粒对小鼠血清中白三烯含量的影响与空白对照组相比,模型组小鼠血清中白三烯含量明显升高(P
21、0.001);各给药组相较于模型组小鼠血清中白三烯含量均显著下降(P0.05),结果见图 2。结果表明,消风止痒颗粒能显著降低 AD小鼠血清中白三烯水平,降低炎症水平。*#0.700.650.600.550.500.450.40A(450 nm)空白对照组模型组阳性对照组消风止痒颗粒低剂量组消风止痒颗粒高剂量组 x图 2激发后小鼠血清中白三烯水平(n=6,s)*P0.05,*P0.01,与模型组比较;#P0.001,与空白对照组比较。3.3 消风止痒颗粒对小鼠血液中嗜碱性粒细胞的影响模型组小鼠血液中 CD49b+细胞和 FceRla+细胞以及 CD200R+细胞的比例显著高于空白对照组(P0.
22、05),消风止痒颗粒高剂量组与模型组相比较,能明显降低 CD49b+细胞和 FceRla+细胞以及CD200R+细胞的比例(P0.05),结果如图 3图 5所示。CD49b 和 FceRla 以及 CD200R 为嗜碱性粒细胞表面抗原7,两者升高表明小鼠血液中嗜碱性粒细胞比例升高,而消风止痒颗粒能降低由特异性皮炎引起增多的嗜碱性粒细胞,减少炎症反应,进而减轻瘙痒症状。4讨论AD 是一种以皮肤持续瘙痒为特征的复发性、慢性、非感染性炎症性皮肤病。其发病机制是多种因素共同作用的结果,涉及表皮屏障功能受损、免疫异常、宿主遗传因素和环境因素的相互作用。表皮的最外层,角质层和颗粒层的紧密连接形成蛋白质和脂
23、质屏障,防止皮肤种水分的流失、微生物病原体的入侵,以及过敏原、毒素和刺激物引起的炎症反应。AD 发生后,皮肤屏障受损,表皮分化蛋白(特别是聚丝蛋白)和紧密连接蛋白表达减少,脂质,特别是长链脂肪酸和神经酰胺缺乏。由于抗菌肽(AMP)对环境病原体(包括金黄色葡萄球菌)的反应不足,使皮肤对微生物的屏障作用也被削弱8。国内外报道中,皮肤源性瘙痒动物模型是药物止痒研究实验最常使用的类型,由于不同药物作用机制、疾病生理病理特征不同,使用的模型也不尽相同。近年来,越来越多的新品系、新技术、新途径 药学实践与服务2024 年 5 月 25 日第 42 卷第 5 期 Journal of Pharmaceuti
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