全身过表达人METRNL基因小鼠模型的构建与验证 (1).pdf
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1、 论著 全身过表达人METRNL基因小鼠模型的构建与验证王雪莲1,郑斯莉2,李志勇2,罗亨宇2,缪朝玉1,2(1.上海大学医学院,上海 200444;2.海军军医大学药理学教研室,上海 200433)摘要目的构建全身过表达人 METRNL 基因的小鼠模型(R26-L-METRNL+/-小鼠)。方法基于 Cre-loxP 系统利用 Dppa3-Cre 小鼠和实验室前期构建的人 METRNL 基因条件性过表达(R26-LSL-METRNL+/-)小鼠进行交配繁殖,得到目标R26-L-METRNL+/-小鼠。将该目标小鼠进行基因型鉴定,收集其血液及心、肝、脾、肺、肾、脑、白色脂肪和肌肉组织,利用实时
2、荧光定量 PCR 技术、蛋白免疫印迹实验和血清酶联免疫吸附实验,考察人 METRNL 基因在小鼠的表达情况。结果R26-L-METRNL+/-小鼠的人 METRNL 在组织 mRNA 水平、组织蛋白水平和血液蛋白浓度方面都有显著表达,远高于野生对照组小鼠。结论R26-L-METRNL+/-小鼠模型构建成功。关键词 分泌蛋白;全身过表达;小鼠文章编号 2097-2024(2024)05-0198-05DOI 10.12206/j.issn.2097-2024.202311014Constructionandvalidationofamousemodelwithsystemicoverexpres
3、sionofhumanMETRNLgeneWANG Xuelian1,ZHENG Sili2,LI Zhiyong2,LUO Hengyu2,MIAO Chaoyu1,2(1.School of Medicine,Shanghai University,Shanghai 200444,China;2.Department of Pharmacology,Naval Medical University,Shanghai 200433,China)AbstractObjectiveTo generate mice with whole-body overexpression of human M
4、ETRNL gene.MethodsBased onCre-loxP system,Dppa3-Cre mice were mated with Rosa26-LSL-METRNL knock-in mice(R26-LSL-METRNL+/-)to generate R26-L-METRNL+/-mice.The genotypes of the offsprings were identified,and tissues of the blood,heart,liver,spleen,lung,kidney,brain,white adipose and muscle were colle
5、cted.The expression of human METRNL gene in mice was investigated by quantitative real-time PCR,western blot and enzyme linked immunosorbent assay.Results Compared with wild type control mice,humanMETRNL in R26-L-METRNL+/-mice significantly expressed at both mRNA and protein levels in tissues,with a
6、bundant METRNLprotein in blood.ConclusionThe mouse model overexpressing human METRNL gene(R26-L-METRNL+/-mouse)was successfullyconstructed.Keywords METRNL;systemic overexpression;mouseMETRNL(Meteorin-like)是一个新发现的分泌蛋白,为神经营养调节因子 Meteorin 的同源蛋白。2014 年,本实验室首次报道 METRNL 是一个新的脂肪因子,由于其在皮下白色脂肪组织中表达很丰富,故也称为 S
7、ubfatin1。10 年来,我们对 METRNL的功能进行了多方面的探索,并不断扩展 METRNL的研究工具与平台。我们的研究已发现,该蛋白参与调节机体多种病理生理过程,比如:脂肪细胞METRNL 可促进白色脂肪分化、脂质代谢并抑制脂肪炎症,从而抵抗高脂饮食诱导的胰岛素抵抗2;肠上皮细胞 METRNL 参与调节肠道抗菌肽的平衡3,且肠道 METRNL 缺乏会加重溃疡性结肠炎4;此外,METRNL 促进小鼠皮肤创伤愈合5,并能对抗D-半乳糖诱导的衰老小鼠的认知功能障碍6。最近,我们新报道了血液 METRNL 的主要分泌来源是血管内皮细胞,并发现内皮细胞 METRNL 对维持血管内皮正常功能和对
8、抗动脉粥样硬化具有重要作用7。在这些研究中,我们构建 METRNL 基因的全身性和各种组织特异性的敲除小鼠,以及多种双基因敲除小鼠,并在体外细胞实验中充分利用METRNL 重组蛋白探索相关治疗学意义。除了本实验室,全球其他多个实验室也展开了对 METRNL的功能探索,并发现 METRNL 在能量代谢8-9、炎 基金项目国家自然科学基金重点项目(82030110,82330117);国家自然科学基金青年科学基金项目(82104165);上海市青年科技英才扬帆计划(21YF1457600)作者简介王雪莲,硕士研究生,研究方向:心脑血管药理学,Tel:19822717670,Email:通信作者缪朝
9、玉,教授,博士生导师,研究方向:心脑血管药理学,Email: 药学实践与服务2024 年 5 月 25 日第 42 卷第 5 期 198Journal of Pharmaceutical Practice and Service,Vol.42,No.5,May 25,2024 症10-11、心脏疾病12-13等多种病理生理过程中发挥积极作用。尽管目前有很多关于 METRNL 的研究结果提示,该蛋白具有非常好的临床治疗潜力,但有关整体 METRNL 治疗学探索不多,尤其是长期治疗研究几乎没有。主要原因之一是市场 METRNL 重组蛋白价格昂贵,而且我们前期研究结果发现:对C57BL/6J 小鼠单
10、次静脉注射 1.75 g METRNL 重组蛋白后,血清 METRNL 在 15 min 后急剧升高(226 ng/ml),接着在 4 h 内迅速下降约 90%。虽然在注射后 24 h 仍明显高于基础水平,但此时血中METRNL 浓度已下降约 97%2。因此,以重组蛋白给药方式在动物整体水平研究 METRNL 的治疗学作用,尤其是长期治疗学作用将产生巨大经济成本。另一方面,对于一些已经体现 METRNL 治疗潜力的疾病(如动脉粥样硬化),疾病发展缓慢,短期给予 METRNL 重组蛋白很难起到治疗作用。因此,本研究旨在构建一株长期稳定高表达METRNL 的小鼠作为 METRNL 的治疗学研究工具
11、,并对该小鼠高表达 METRNL 的情况进行验证。1材料与方法 1.1 实验试剂和仪器鼠尾 DNA 提取试剂盒(CW2094S)购自北京康伟试剂生物科技有限公司;5 PrimeScript RTMaster Mix(Takara 公司);小鼠Tubulin 抗体(AT819,碧云天公司);通用型 RNA 提取试剂盒(AG21022,艾瑞克生物科技);Human Meteorin-like/METRNLDuoSet ELISA 试剂盒(DY7867-05,R&D system 公司);山羊抗兔 IgG(ab175471)、山羊抗小鼠 IgG(ab216772)、抗 METRNL 抗体(ab235
12、775)购自Abcam 公司。LightCycler96 实时荧光定量 PCR 仪(Roche公司);TP600PCR 仪(Takara 公司);5200S 化学发光分析系统(Tanon 公司)。1.2 实验动物人 METRNL 基 因 条 件 性 过 表 达(R26-LSL-METRNL+/-)小鼠为实验室前期构建所得。SPF 级8 周龄 C57BL/6J 小鼠和 Dppa-Cre 小鼠购自上海南方模式生物技术有限公司。所有实验小鼠均饲养在独立通气笼盒(IVC)系统中,温度(242),相对湿度为 40%60%,饲养期间笼盒内保持清洁,小鼠在笼内自由活动、进食及饮水,动物房内照明系统为自动控制
13、(12 h 照明、12 h 黑暗)。动物实验标准均依照国家实验动物护理使用卫生指南,并经过海军军医大学医学研究伦理委员会批准指导。1.3 实验方法 1.3.1 动物基因型鉴定将剪刀消毒后剪取小鼠尾尖约 3 mm,剪碎,按照 DNA 提取试剂盒的说明书方法提取 DNA 之后,对目的基因进行 PCR 扩增,各引物序列见表 1。表1PCR 扩增实验中的引物序列 基因名称上游引物(53)下游引物(53)R26-WTTCAGATTCTTTTATAGGGGACACATAAAGGCCACTCAATGCTCACTAAR26-L-METRNLAAAGTCCCGGAAAGGAGCTGGAGGCTCCATCCAGC
14、AAGTTR26-StopGGGCAACGTGCTGGTTATTGACTTGCCCCTTGCTCCATAC内参基因TGGGTTGGGTGTCTGTTTCATTGTGATCCACCTGTCTCTGCCTTCCDppa-CreTGGGTTGGGTGTCTGTTTCATTGTGACCTTGCATTCCTTTGGCGAGAG 将 PCR 产物进行 1.2%琼脂糖凝胶电泳,上样量为每孔 6 l,电泳条件为 100 V,30 min,结束后进行拍照、分析。1.3.2 小鼠取材将小鼠称重后,腹腔注射 1%戊巴比妥钠溶液(100 mg/kg),待小鼠处于深度麻醉后,打开其胸腔,自上下腔静脉汇合处缓慢抽取血液,
15、并转移至1.5 ml EP 管静置于室温。迅速剪取小鼠心、肝、脾、肺、肾、脑、白色脂肪和肌肉组织,放入组织冻存管扔进液氮速冻,待取材结束后及时转入80 超低温冰箱储存。血液于室温静置 2 h 后离心:4,3 000g,15 min,分离血清,储存至80 超低温冰箱。1.3.3 实时荧光定量 PCR 实验使用 RNA 提取试剂盒提取组织 RNA,将得到的 RNA 进行浓度测定与吸光度测定后进行逆转录,得到 cDNA 用于实时荧光定量 PCR 实验,各引物序列见表 2。1.3.4 蛋白免疫印迹实验取适量组织至 2 ml 高速离心管,加入蛋白裂解液后,使用高通量匀浆仪匀浆 240 s。取出高速离心管
16、,离心:12 000 g,20 min。将上清液转移至 药学实践与服务2024 年 5 月 25 日第 42 卷第 5 期 Journal of Pharmaceutical Practice and Service,Vol.42,No.5,May 25,2024199 另一干净 1.5 ml EP 管中,进行蛋白浓度测定,剩余样品加入 5 蛋白上样缓冲液,97 变性 10 min得到蛋白样品。使用 10%SDS-PAGE 凝胶进行电泳,电泳条件为:150 V,60 min。使用 PVDF 膜进行转膜,转膜条件为 100 V,60 min。转膜结束后,使用快速封闭液封闭 15 min,之后使用
17、 1TBST 缓冲液洗膜,5 min 3 次。加入一抗(11 000 稀释)4 孵育过夜。次日去除一抗孵育液,使用 1 TBST 缓冲液洗膜,5 min 3 次。加入二抗孵育液(12 000 稀释)常温孵育 1 h,用1 TBST 缓冲液洗去二抗,5 min 4 次,结束后即可进行扫膜。1.3.5 血清酶联免疫吸附实验使用酶联免疫吸附实验试剂盒(DY7867-05)测定小鼠血清中的 METRNL 水平,具体操作按照试剂盒说明书进行。1.3.6 统计学分析实验数据使用 GraphPad Prism 8.0 进行统计分析。两组间的比较使用双尾 t 检验,P0.05 视为差异有统计学意义。2结果 2
18、.1 全身过表达人 METRNL 基因小鼠的构建和基因型鉴定本研究基于前期构建好的人 METRNL 基因条件性过表达小鼠(简称为 R26-LSL-METRNL+/-小鼠)和 Cre-LoxP 技术,最终获得全身过表达人 METRNL基因小鼠(简称为 R26-L-METRNL+/-小鼠),具体构建策略如图 1 所示。Exon 2Exon 1Exon 1Exon 1CAGMETRNL-3XFlagWpre-pAWpre-pAWpre-pALoxPExon 2Exon 2CAGCAGSTOPSTOPRosa 26 位点靶向载体3靶向等位基因4Cre重组酶METRNL-3XFlagMETRNL-3XF
19、lag图 1全身过表达人METRNL基因小鼠的构建策略 R26-LSL-METRNL+/-小鼠是前期通过 CRISPR/Cas9 基因编辑技术构建而成,即在其中一个 Rosa26基因位点定点插入了CAG-LoxP-Stop-LoxP-METRNL-3XFlag-Wpre-pA 表达框,且该表达框的终止密码子 Stop 两侧插有同向 LoxP 位点,可基于 Cre-loxP系统在 Cre 酶的作用下,将 LoxP 位点之间的序列切除,只留下一个 LoxP 位点,最终达到人 METRNL基因过表达的目的。在该小鼠的名称“R26-LSL-METRNL+/-”中,“+”表示有外源基因表达框的插入,“-
20、”表示无外源基因表达框插入。Dppa3-Cre 小鼠是由 Dppa3 基因启动子介导Cre 重组酶在全身表达的工具鼠,将 R26-LSL-METRNL+/-小鼠和 Dppa3-Cre 小鼠杂交,可获得R26-L-METRNL+/-小鼠,具体繁殖方法如图 2 所示。其中,野生对照小鼠简写为 R26-WT,表示在 Rosa26位点没有外源人 METRNL 基因表达框的插入。在繁殖过程中进行基因型鉴定时,需确认外源人 METRNL 基因表达框、终止密码子 Stop 和 Dppa-Cre 基因的存在情况。采用相应基因上下游引物分别进行鼠尾基因型鉴定,外源性表达框阳性条带为 699 bp,对应野生型序列
21、条带为 996 bp,终止密码子 Stop 阳性条带为 408 bp,Cre 基因阳性条带为100 bp。如图 3 所示,泳道 1 为 R26-LSL-METRNL+/-小鼠,泳道2 为R26-L-METRNL+/-小鼠,泳道3 为R26-WT 小鼠,泳道 4 为 R26-L-METRNL+/-Cre 小鼠,泳道 5 为 R26-WT;Cre 小鼠。表2实时荧光定量 PCR 实验中的引物序列 基因名称上游引物(53)下游引物(53)人 METRNLACCAGCGACTTCGTAATTCACCAGCTCCACGTCATGGGTG小鼠 GapdhGTATGACTCCACTCACGGCAAAGGTC
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