miR395a-MdWRKY26调控苹果植物耐盐的分子机制.pdf
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1、北京农学院学报2 0 2 4,39(2):2 5-31Journal of Beijing University of Agriculturehttp:/doi:10.13473/ki.issn.1002-3186.2024.0205miR395a-MdWRKY26调控苹果植物耐盐的分子机制刘荣欣,刘嘉伟1,张嘉琪1,侯宗甫1,王志英2*(1北京农学院植物科学技术学院/农业应用新技术北京重点实验室,北京10 2 2 0 6;2.北京农业职业学院,北京10 0 0 31)摘要:【目的】为了揭示miR395a-MdWRKY26表达模式在盐处理下调控苹果耐盐性的分子机制,并且为苹果耐盐新品种的选育提
2、供基础。【方法】以“嘎啦野生型苹果苗和通过稳定遗传转化方法得到的miR395a-OE、miR395a-RNAi、M d W RK Y 2 6-O E、M d W RK Y 2 6-RNA i转基因苹果苗为试验材料,对其进行2 0 0 mM的NaCl处理,观察表型并且用RT-qPCR检测盐处理下的表达量,用紫外分光光度计法测量丙二醛含量。【结果】结果表明,2 0 0 mM的NaCI处理后,与对照相比,miR395a-OE和MdWRKY26-RNAi转基因植株受到的伤害程度较高,对盐更敏感;而MdWRKY26-OE和miR395a-RNAi转基因植株受到的损害程度较轻,表明植株Md-WRKY26-
3、OE和miR395a-RNAi转基因植株具有耐盐性。【结论】通过耐盐性分析,得到miR395a基因负调控苹果耐盐性,而MdWRKY26基因发挥正调控作用。揭示了miR395a-MdWRKY26调控苹果耐盐性的分子机理,可以减弱植物在盐处理下受到的伤害。关键词:苹果;盐处理;miR395a;M d W RK Y 2 6中图分类号:S661.1文章编号:10 0 2-318 6(2 0 2 4)0 2-0 0 2 5-0 7 文献标志码:AThe molecular mechanism of miR395a-MdWRKY26regulating salt tolerance in apple pl
4、antsLIU Rongxin,LIU Jiawei,ZHANG Jiaqi,HOU Zongfu,WANG Zhiying?*(1.College of Plant Science and Technology,University of Agriculture/Beijing Key Laboratory of Agricultural Application NewTechnology Beijing Agricultural University,Beijing 102206,China;2.Beijing Agricultural Vocational College,Beijing
5、 100031,China)Abstract:ObjectiveJIn order to reveal the molecular mechanism of miR395a-MdWRKY26 expression pattern downregulatingsalt tolerance in apples under salt treatment,and to provide a basis for the breeding of new salt tolerant apple varieties.Meth-odsJWild type apple seedlings of Gala and t
6、ransgenic apple seedlings of miR395a-OE,miR395a-RNAi,MdWRKY26-OE,andMdWRKY26-RNAi obtained through stable genetic transformation were used as experimental materials.They were treatedwith 200 mM NaCl to observe the phenotype and detect the expression level under salt treatment using RT qPCR.The conte
7、ntof malondialdehyde was measured using UV spectrophotometer.ResultsJThe results showed that after 200 mM NaCl treat-ment,compared with the control,miR395a-OE and MdWRKY26-RNAi transgenic plants were more susceptible to damage andwere more sensitive to salt;The damage to the MdWRKY26-OE and miR395a
8、RNAi transgenic plants was relatively mild,indi-cating that the MdWRKY26-OE and miR395a RNAi transgenic plants have salt tolerance.ConclusionJThrough salt toleranceanalysis,it was found that the miR395a gene negatively regulates salt tolerance in apples,while the MdWRKY26 gene plays apositive regula
9、tory role.The molecular mechanism of miR395a-MdWRKY26 regulating salt tolerance in apples has been re-vealed,which can weaken the damage to plants under salt treatment.Keywords:Malus domestica;salt stress;miR395a;MdWRKY26收稿日期:2 0 2 3-12-2 0基金项目:国家自然基金资助项目“McmiRNA156a/396b共调控苹果春稍生长与春色的分子机制”(2 0 2 32
10、0 2 0 8 8/0 0 1)第一作者:刘荣欣(19 9 9 一),女,内蒙古赤峰人,硕士研究生,研究方向为果树种质资源利用与创新,Tel:15049935752,E-m a i l:2 2 8 30 2 17 15 q q.c o m通信作者:王志英(198 7 一),女,河北邢台人,硕士,助理研究员,研究方向为园林植物种质资源研究与利用,Tel:15811452635,E-mail:26北京农学院学报第39卷苹果(Malus domestica)是中国的主栽果树,黄土高原是中国苹果的主要产地,其土壤盐渍化现象1材料与方法严重影响该区域苹果产业的高质量发展。苹果在生长发育过程中会遭受各种各
11、样的外界因素影响,例如盐渍,气候寒冷,土壤干燥、重金属等非生物的处理。作物会根据遗传基质的差异从而表现出相应的耐盐性 2 。伴随不规范的种植及过量的浇灌,会造成土地发生次生盐渍化现象,每年水涝及盐害占全球二分之一的土地,其中会有110 7 hm的盐碱地会因此而荒废。众所周知,植物的生长要依靠必需无机盐,如果土地的盐分过量,植物体内将发生渗透处理,大量盐离子进人细胞中,导致 Na+过多,K+/Na+离子比严重失衡,出现离子毒害,盐分浓度过高,会增加渗透势,从而造成植物叶片边缘黄化枯竭死亡 3,从而影响植物的生长发育L4-5。microRNAs(miRNAs)是一类内源性且非编码的小分子RNA,分
12、别在植物参与处理应答与生长发育的历程中发挥首要调节作用 6 。多年以来,随着高水平的高通量测序技术被人们广泛运用,有研究报道存在植物体内的miRNAs有着高度的保守性,同时在参与植物的生长与发育,多种处理应答等方面发挥作用 7-8 。盐处理下对油菜种子进行2 0 0mM的NaCl处理,发现miR393和miR399基因呈现表达下调趋势 9。此外,毛果杨miR398的表达在受盐害的诱导下,其表达水平随时间的改变而发生改变 10。不同的miRNA之间会依据处理程度的不同而发生相应的表达变化,以此面临处理带来的损害。有大量研究发现,WRKY转录因子也在多种处理途径中参与调控 1。WRKY转录因子在响
13、应盐处理方面会与其他基因相互之间作用形成一种调控网络,当盐害发生时,会破坏植物体内的ROS、Na+/H+离子失衡,破坏内环境稳定,从而影响植物的生殖生长 12 。过表达小麦TaWRKY2、TaWRKY19的可以提高物种本身对盐旱处理的抵抗性,同时也提高对低温处理的抗性证明microRNAs(miRNAs)以及WRKY基因都对植物处理起着至关重要的作用 13。有的文章中预测到miRNA与WRKY基因可能会形成一种靶向关系,通过miRNA与WRKY基因共同来调控植物的耐盐性。该研究通过稳定遗传转化获得转基因材料,并通过分析其在盐处理下的表达模式,揭示miR395a-MdWRKY26调控苹果耐盐性的
14、分子机理,可以减弱植物在盐处理下受到的伤害并且也为苹果耐盐新品种的选育提供了基础。1.1植物材料以2 6 d生长健壮的嘎啦苹果组培苗为材料,植物材料来自于北京农学院组培中心,在MS培养基中进行组织培养(4.43g/LMS十30 g/L蔗糖+0.5mg/L6-BA+0.05mg/LNAA+Agar 7.6g/L,p H=5.8 7 5.8 8),培养条件:温度2 4左右,相对湿度7 5%左右,光照强度19 0 0 1x左右,光照时间为16 h光/8 h黑暗。1.2试验方法1.2.1盐处理嘎啦苹果苗将“嘎啦 苹果组培苗在生根培养基中进行生根后,洗净根部培养基,种植在壤质土中,生长14d后,用2 0
15、 0 mM的NaCl处理,观察0、7、14d受盐处理的表型情况、记录并取样,储存于一8 0 用于后续试验。1.2.2盐处理下嘎啦 苹果叶片MDA含量测定剪取盐处理下的嘎啦苹果叶片测定含量,具体步骤参见说明书:丙二醛的含量检测试剂盒(品牌:Solarbio|货号:BC 0020)。1.2.3“嘎啦 苹果叶片总RNA提取及mRNA、miRNA合成总RNA提取试剂盒(诺唯赞,货号RC411)进行植物材料RNA提取,miRNA提取试剂盒(全式金,货号ER601-01)进行植物材料miRNA提取,得到的总RNA进行琼脂糖凝胶电泳检测,用紫外分光光度计测得总RNA浓度,用反转录试剂盒(全式金及湖南艾科瑞生
16、物工程有限公司)进行mRNA、m i RNA 合成。1.2.4?实时荧光定量PCR?参照SYBRGreenPro TaqHS预混型qPCR试剂盒进行,采用 SYBRGreen嵌合荧光法,反应体系按照说明书进行。反应条件:预变形、变形、退火、延伸的温度与时间分别是9 530 s,9 55s,6 0 30 s,40 次循环。测定嘎啦苹果苗中miR395a和MdWRKY26基因的表达水平。1.2.5miR395a、M d W RK Y 2 6 稳定遗传转化试验室前期保存的质粒转化农杆菌中,用平板划线法将获得正确菌液在固体 LB培养基(含 Spe和 Rif的)上划线操作,之后在培养箱中放置3d;挑单菌
17、落至LB液体培养基内(含Spe和Rif抗性),2 8、200 rpm,过夜培养;次日,进行菌落PCR鉴定,将得到的正确菌液转人含2 5mL液体LB(含Spe和Rif抗性)中,在2 8 条件下,2 0 0 rpm振荡8 h;然后室2024年第2 期温6 0 0 0 rpm离心6 min收集菌体;配制液体培养基(4.43g/L的MS、2 5g/L的蔗糖),进行菌液悬浮至OD600=0.5,吸2 0 L乙酰丁香酮(AS)至10 0mL重悬液内,可以增加转化率。将继代生长2 6 d的嘎啦组培苗叶片剪成0.4cmX0.5cm的小叶块;放人重悬液内浸泡1min,轻晃15s,重复3次;擦净叶片残留农杆菌菌液
18、,叶背向下,立即摆放至培养皿上进行共培养;2 5的条件下黑暗培养3d;将叶片取出在液体培养基中进行晃动,脱菌6 min,重复1次;擦净叶表面的农杆菌菌液;最后转移到固体再生培养基上,暗培养14d后;开始出现愈伤组织和不定芽,将其转移到光下培养;当不定芽长大后,转至嘎啦 苹果继代培养基中进行正常培养。1.2.6转基因植株的鉴定首先用(货号:DC104-O1)诺唯赞试剂盒,提取叶片总DNA,具体操作步骤参见说明书。获得的DNA用来做RT-PCR鉴定的模板,用琼脂糖凝胶电泳仪筛选正确条带。实时荧光定量PCR检测需要用到的模板是通过选取嘎啦野生型植株、miR395a-OE、m iR39 5a-RNA
19、i、MdWRKY26-OE、M d W RK Y 2 6-RNA i的转基因植株叶片,提取其总RNA并进行反转录所得到的,内参基因是18 S和U6,试验方法是SYBRGreen嵌合荧光法。1.2.7转基因植株盐处理生长良好大小一致的嘎啦野生型植株、miR395a-OE、m i R39 5a-RNAi、M d W RK Y 2 6-O E、M d W RK Y 2 6-RNA i转基因植株用2 0 0 mM的NaCl盐处理下的表达变化分析分别在0 d、3d、6 d 观察表型并拍照取样,然后液氮冻存于一8 0 超低温冰箱,重复试验3次。表 1 引物序列Tab.1Primer sequence刘荣欣
20、等:miR395a-MdWRKY26调控苹果植物耐盐的分子机制“嘎啦 苹果耐盐性分析2.1.1嘎啦 苹果植株在不同盐浓度处理下的表型分析以嘎啦 苹果组培苗作为材料,用不同浓度NaCl的MS培养基进行耐盐分析,初步研究不同盐浓度对植株叶色、萎焉程度以及生长发育的影响。可见,在不同的盐处理之间存在明显差异,在50 mM、10 0 m M 的NaCl浓度处理,植株正常生长,在150 mM的NaCl浓度处理后的植株叶片开始出现黄化、萎焉状况,在2 0 0 mM的NaCl浓度处理后,可以明显看出植株的各个叶片都出现干枯、黄化萎状态,而2 50 mM的NaCl浓度的植株呈致死症状,因此,以2 0 0 mM
21、的NaCl 确定植株存活的临界盐浓度。2.1.2盐处理下植株的生长状态随着2 0 0 mM的NaCl处理时间的不断增加,嘎啦 苹果幼苗出现了叶片黄化、干枯的现象。在盐处理7 d后,嘎啦 苹果幼苗叶片略微出现萎焉、变黄状态;盐处理14d后,嘎啦苹果幼苗的各个叶片出现焦枯并变黄,植株濒临死亡。因此,研究表明,“嘎啦苹果幼苗响应盐胁迫。2.1.3盐处理下叶片丙二醛含量变化丙二醛(MDA)在处理条件下可以反应植物受损程度,分别测定嘎啦苹果幼苗在盐处理后的0、7、14d的MDA含量,由图1可以发现,处理时间越久,叶片内丙二醛的含量积累越多,植物受损越严重。257ab20F二(3/owu)/vaN15上2
22、72结果与分析2.1长度名称ID引物序列(5-3)Primersequence(5-3)miR395a-FTACCCAAGCAATCAAAAACAGTATAmiR395a-RTACCCAAGCAATCAAAAACAGTATAWRKY26-FTCTCTCTCTGTCTTCTCTCTCTTGTTTGWRKY26-RGCGCAGCAAAGATTCAAAAAATGCAGFP-FATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGGFP-RCTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAG277载体-FATCCGTATTTTTACAACAATTACCAq18S-FGTCACTACCTCCCCGTGTCAq18S-R
23、GAGCCTGAGAAACGGCTACCU6-FATTGGAACGATACAGAGAAGATTUniversalGATCGCCCTTCTACGTCGTATprimerqmiR395aqWRKR26-FWRKY26-RCCGCGAAGCCGTAAGTTCCTTG10Flength/bp2525282721232320212421CGAACTTATTGCAACTAGCTT21TTGAGGCAACCAACATCAGAAGGG2522C50注:每组数据显示为平均值X土SE(n=3);不同的小写字母表示不同处理下数据差异在P0.05,图2,图3,图4,图6.图7 同图1“嘎啦 苹果苗叶片的丙二醛含量的变
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