基于微流控芯片的体外肠道吸收模型构建及其应用进展.pdf
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1、 综述 基于微流控芯片的体外肠道吸收模型构建及其应用进展陈兰1,何晓莉1,游飘雪1,王辉2,3,洪战英1,2,3(1.福建中医药大学药学院,福建 福州 350122;2.海军军医大学药学系,上海 200433;3.上海市药物(中药)代谢产物研究重点实验室,上海 200433)摘要肠道是口服药物吸收的主要部位,肠道的上皮细胞上含有绒毛和微绒毛,它们通过增加表面积等因素促进分泌、细胞黏附和吸收。传统的二维/三维(2D/3D)细胞培养模型、动物模型在研究药物吸收方面发挥了重要作用,但是由于缺乏足够的人体药动学的可预测性或伦理问题等,其应用存在一定局限性。因此,以体外活细胞为基础,模拟人肠道的核心结构
2、和关键功能是构建基于微流控芯片的肠道模型的研究重点。该模型是利用微加工技术制备出的模拟人体肠道的复杂微结构、微环境和生理功能的微流控芯片仿生系统。与 2D 细胞培养和动物实验相比,肠芯片模型能有效地模拟人体内环境,在药物筛选方面更具特异性。本综述概括了国内外肠芯片模型以及与肠道相关的多器官耦合芯片模型的研究进展,及其在疾病建模、药物吸收和转运方面的应用,并总结了当前肠芯片模拟肠道稳态和疾病面临的挑战,为进一步建立更可靠的体外肠芯片模型提供参考。关键词 微流控芯片;肠道吸收模型;微环境;应用文章编号 2097-2024(2024)02-0043-07DOI 10.12206/j.issn.209
3、7-2024.202305003Developmentandapplicationofin vitrointestinalabsorptionmodelbasedonmicrofluidicchipsCHEN Lan1,HE Xiaoli1,YOU Piaoxue1,WANG Hui2,3,HONG Zhanying1,2,3(1.School of Pharmacy,Fujian University of TraditionalChinese Medicine,Fuzhou 350122,China;2.School of Pharmacy,Naval Medical University
4、,Shanghai 200433,China;3.ShanghaiKey Laboratory for Pharmaceutical Metabolite Research,Shanghai 200433,China)AbstractThe intestine is the main site of oral drug absorption,and the epithelial cells of the intestine contain villi andmicrovilli,which promote secretion,cell adhesion,and absorption by in
5、creasing surface area and other factors.Traditional two-dimensional/three-dimensional(2D/3D)cell culture models and animal models have played an important role in studying drugabsorption,but their application is limited due to the lack of sufficient predictability of human pharmacokinetics or ethica
6、l issues,etc.Therefore,mimicking the core structure and key functions of the human intestine based on in vitro live cells has been the focusof research on constructing a microfluidic chip-based intestinal model.The model is a microfluidic chip bionic system that simulatesthe complex microstructure,m
7、icroenvironment,and physiological functions of the human intestine using microfabricationtechnology.Compared with 2D cell culture and animal experiments,the intestinal microarray model can effectively simulate thehuman in vivo environment and is more specific in drug screening.The research progress
8、and applications in disease modeling,drugabsorption and transport of intestinal microarray models and intestine-related multi-organ coupled microarray models at home andabroad were reviewed in this paper.The current challenges of intestinal chip simulating intestinal homeostasis and diseases weresum
9、marized,in order to provide reference for the further establishment of a more reliable in vitro intestinal chip model.Keywords microfluidic chips;intestinal absorption model;microenvironment;applications口服给药是最简单的给药方式,药物是否适合口服给药取决于其在胃肠道中的有效吸收,因此,开发能准确预测口服药物吸收的方法对药物研发相关研究具有非常重要的意义。近几十年来,为了评估临床前开发过程中的口
10、服药物吸收,研究人员们已经建立了多种药物肠吸收的研究方法,主要有体外试验法(in vitro)、在体试验法(in situ)和体内试验法(in vivo)等。动物模型可以模拟整个有机体的生理,但动物模型在肠道生理学以及肠道转运蛋白的表达模式和底物特异性方面与人类有很大不同1。2004 年,美国 FDA 估计,92%通过动物试验的药物未能进入市场,原因是动物试验没有预测到的有效性和安全性问题。此外,动物模型往往具有 基金项目国家自然科学基金项目(82173777,81872829)作者简介陈兰,硕士生,研究方向:微流控芯片模型研究,Tel:19942330467,Email:通信作者洪战英,教授
11、,研究方向:体内药物分析新技术新方法研究,Tel:(021)81871269,Email: 药学实践与服务2024 年 2 月 25 日第 42 卷第 2 期 Journal of Pharmaceutical Practice and Service,Vol.42,No.2,February 25,202443 伦理学争议。与动物模型相比,体外培养细胞模型具有操作简便、成本低、无伦理问题等优点2,研究人员开发了 Boyden Chamber 和 Transwell 等模型来模拟肠道的复杂结构和功能。然而,传统的体外培养细胞模型通常缺乏体内特性,例如,流体流动、周期性蠕动、宿主与微生物之间的串
12、扰以及组织之间的串扰3。随着微制造和 3D 打印技术的发展,肠芯片(gut-on-a-chip,GOC)为体外研究肠道疾病提供了新方法4。基于肠道功能,肠芯片引入了具有不同部件的模块,例如,用于流体流动的注射泵和用于机械变形的压力系统5,用于模拟一些肠道功能,使其更具生理相关性。肠芯片突破了传统细胞培养和动物实验的局限性,具有体积小、高度集成化和高通量等特点。本文综述了目前国内外肠芯片模型以及与肠道相关的多器官耦合芯片模型的研究进展,介绍了基于微流控芯片的肠道模型在疾病建模、药物吸收和转运方面的应用。1肠道基本结构与功能 1.1 小肠的结构肠道是人体重要的消化器官,是从胃幽门至肛门中最长的一段
13、,主要器官功能是进行消化、吸收、分泌和免疫6。肠上皮是人体最大的黏膜表面,覆盖约 400 m2的表面积,单层细胞组织形成隐窝和绒毛结构7。隐窝和绒毛是肠道基本的、具有自我更新功能的结构单位。人体小肠和大肠体内肠隐窝的实际深度分别为 135 m 和 400 m,小肠绒毛的高度为 600 m8。隐窝和绒毛分别包括干细胞增殖和分化细胞区域。在肠上皮的分化绒毛区域中,发现了 3 种主要类型的分化肠上皮细胞(IEC):肠上皮细胞、杯状细胞和肠内分泌细胞9。肠上皮细胞是肠上皮中最常见的细胞,负责消化和吸收肠腔中的营养物质10。杯状细胞分泌的黏液在肠上皮上维持一层连续的黏液,提供保护屏障并有助于润滑肠道内壁
14、11。肠内分泌细胞产生多种激素并调节许多不同的功能12。1.2 肠道屏障肠道屏障是机体内部和外部之间的屏障,允许营养素和液体的吸收,同时阻止有毒、有害物质的侵入,对人体的健康起着重要作用。肠道屏障分为四类:机械屏障、化学屏障、生物屏障和免疫屏障7。机械屏障又称为物理屏障,它能有效阻止有害物质,如细菌、毒素等透过肠黏膜进入机体的其他部位造成肠道损伤引发各类疾病,是人体肠道的第一道防线13。物理屏障主要通过细胞间的紧密连接复合构成,维持肠上皮细胞的完整性和渗透性14。化学屏障由胃肠道各种分泌物包括黏液、胃酸以及各种消化酶、溶菌酶等组成15-16。生物屏障是肠黏膜屏障的重要组成部分,由肠道微生物群附
15、着在肠黏膜层上形成的一个动态稳定的微生物屏障15。免疫屏障由肠道相关淋巴组织及肠上皮固有层中的免疫细胞组成,如潘氏细胞、巨噬细胞、树突状细胞、淋巴细胞等,可分泌各种抗菌肽、IgG 和细胞因子,维持肠道内稳态17。1.3 肠道吸收和转运与体内外肠道模型药物在胃肠道黏膜上皮细胞的吸收过程是药物在生物膜两侧的跨膜转运过程,药物的跨膜转运方式主要分为被动转运、转运体介导的主动转运和膜动转运等。口服药物在肠道的吸收不仅是简单的被动转运,还通过肠道上皮细胞的药物转运体来实现,其中,转运体参与的主动转运在药物吸收过程中起关键作用18。根据底物的转运方向,可以将转运体分为摄入型转运体和外排型转运体两大类,它们
16、控制着肠黏膜屏障的通透性,影响了药物的生物利用度19。为了研究肠道屏障功能及药物吸收特征,研究人员开发了各种体外和离体肠道吸收模型。将细胞外基质(ECM)包被肠上皮细胞置于 Transwell 培养装置中,常用于研究肠道屏障功能或药物吸收。但这种 2D 培养模式没有介质流动或施加机械应变,不能再现肠细胞和组织形态或重建其他关键的肠分化功能,肠绒毛无法分化,肠道分泌功能受到抑制20。为实现 3D 肠道细胞模型的建立,研究人员使用不同支架包埋细胞。Li 等21使用胶原凝胶作为支架,将共培养的 Caco-2/HT29-MTX 单层细胞和两种基质细胞(成纤维细胞和免疫细胞)合并到胶原凝胶中,与 Cac
17、o-2 细胞的单层培养相比,构建的 3D 模型显示出更多的生理相关特征。研究表明,使用胶原凝胶作为支架的 3D 肠道模型可能成为研究肠道内药物转运的有前景的工具。但其也有一定的局限性,在长时间培养过程中,由于胶原蛋白降解,细胞穿透基质形成多层细胞,导致 Caco-2细胞在胶原支架上的培养,绒毛高度缩短22。另外一些离体模型,如外翻囊模型23、Ussing 腔模型24和 InTESTineTM25在生理学上高度相关,但这些模型的吞吐量和寿命往往有限(最长可达 68 h)。2基于微流控芯片的肠道吸收模型常规的肠道体外模型缺乏对组织结构的真实模拟、缺乏微生物群,以及肠道功能的复杂性,例如 药学实践与
18、服务2024 年 2 月 25 日第 42 卷第 2 期 44Journal of Pharmaceutical Practice and Service,Vol.42,No.2,February 25,2024 蠕动和流动。随着微流控技术的飞速发展,基于微流控的肠芯片成为了模拟人体胃肠道的有效途径。如图 1 所示,肠道微环境的关键因素包括肠道的 3D 绒毛结构、蠕动运动和肠屏障功能等26。为了真实地模拟人体肠道,肠芯片模型应能实现以下功能:通过体外拉伸细胞培养膜来模拟蠕动样运动;通过控制流体来再现肠道复杂的 3D 绒毛结构;通过控制微流体的设计结构和材料的渗透性来产生生理氧梯度:通过多细胞共
19、培养的方式,研究肠道与其他组织或肠道-微生物之间的互作关系。肠道微环境微生物免疫细胞生化因素流体剪切力机械刺激蠕动结构3D组织结构 图 1肠道微环境关键特征26 2.1 肠道芯片设计在过去的 10 年中,肠道芯片平台已经从简单的 2D 结构发展到包括更全面的功能,例如绒毛结构、肠道蠕动、氧梯度,甚至免疫系统。在肠道器官芯片发展的过程中,肠芯片的类型主要分为两种:二维夹膜肠芯片和三维绒毛肠芯片。二维夹膜肠芯片最常见的设备结构包含两个通道(上部和下部),由半透膜(例如聚碳酸酯或聚酯材料)隔开,在膜上生长的肠上皮细胞形成单层上皮的顶端和基底外侧,这种简单的 2D 模型通常用于评估药物和营养吸收的体外
20、药动学特性。Kimura 等27开发了一种集成泵式循环装置和光学检测功能的微流控模型,该模型由被胶原蛋白涂层的半透膜分隔的两层通道组成,以抗癌药物环磷酰胺的渗透评价其吸收功能。Shah 等28设计了一种基于微流控芯片的人类-微生物共培养模型“人与微生物交互系统”(HuMiX),见图 2。培养基灌注微腔室与人肠上皮细胞培养微腔室之间用微米多孔膜(孔径 1 m)隔开,人肠上皮细胞培养微腔室与微生物培养微腔室之间用纳米多孔膜(孔径 50 nm)隔开,每个微腔室有独立的进出口,该模型还集成了光电二极管用于监测溶解氧的浓度。2D 肠道芯片模型可以模拟肠道细胞上的流体剪切应力,以减少对细胞和培养基的需求,
21、但该模型仍缺乏模拟肠道组织关键特征的功能。三维绒毛结构的实现对于构建体外肠道模型至关重要,肠道内的绒毛微结构不仅是肠上皮层的生理屏障,更重要的是增加了肠表面的吸收面积。虽然有报道称在平面基质上自发形成绒毛,但缺乏对绒毛尺寸和分布的控制,而且重复性差。微型3D 支架的集成已经成为更好地再现人类肠道结构的解决方案。Shim 等29植入了胶原蛋白支架,以重现肠道组织三维绒毛结构,绒毛高度为 300 m,绒毛间距为 150 m。3D 条件下 Caco-2 细胞增殖良好,均能形成肠屏障。此外,将细胞置于灌注培养的 3D 培养条件下,可显著提高细胞的代谢活性。Costello 等30利用激光雕刻翻模的技术
22、制作了一种肠道芯片,在这种芯片中细胞依附于所制作的绒毛生长;但是激光雕刻在模具的制作中有一定局限性。激光雕刻利用激光垂直切割平面基底,制作出的模型多为柱状结构,较难制作出更为复杂的 3D 模型。张忆恒等31通过 3D 打印技术与表面微结构转移方法,成功地模拟了更为复杂的肠道绒毛。2.2 流体控制在肠道中,剪切力在细胞分化中起着重要作 药学实践与服务2024 年 2 月 25 日第 42 卷第 2 期 Journal of Pharmaceutical Practice and Service,Vol.42,No.2,February 25,202445 用,包括增强黏液产生、增加线粒体活性和提
23、高药物吸收32。2D 培养时细胞保持在静态条件下,动态参数不容易模拟。在微流控装置中,流体流动可以通过蠕动泵、注射器泵、重力或静水压力以及压力发生器产生,模拟体内液体流动的范围及其在细胞表面的相关剪切应力。与静态条件相比,在连续流动和循环应变下,Caco-2 细胞经历细胞分化、极化、绒毛形成、屏障完整性维持、黏液产生等。GOC器件的剪切应力一般取值在 0.01 0.06 dyn/cm2之间,大多数模型中的剪切应力是使用蠕动泵引入的,但这些装置体积庞大且吞吐量低。Tan 等33用 2 个微型蠕动泵克服了低吞吐量的限制,每个泵有 8 个泵管路,允许流体通过 16 个微通道输送,通过测量微流控芯片中
24、培养的 Caco-2 细胞氨肽酶活性评估其生长和分化速度,与第 21 天的静态培养的 Transwell 系统相比,微流控装置中的 Caco-2 细胞在第 5 天显示出更高的氨肽酶活性。尽管该系统具有简单、高通量的特点,但这些模型在重现定义的流速方面是有限的。Kim 等34开发了一个具有流体流动和施加循环机械应变的肠芯片模型。该装置由两个微通道组成,两侧有两个空心腔室,在空心腔室中施加真空,使分离通道的多孔膜单向延伸。该研究发现,流体流动和周期性机械应变的结合导致了褶皱的形成,这些褶皱再现了肠绒毛的结构,并且该系统中使用的 Caco-2 细胞显示出极化柱状形态,大小与体内上皮细胞相似。2.3
25、机械力刺激在消化过程中,蠕动是由平滑肌与肠神经系统协同作用,在整个胃肠道内产生的食物的不自主的、周期性的推进。蠕动有助于食物消化、营养吸收和肠排空,但也对上皮产生剪切力和径向压力。研究表明,机械拉伸对于准确模拟人体肠道生理、允许细胞分化和防止细菌过度生长至关重要35。Jing 等36提出并构建了一种基于循环变化流体压差原理的新型蠕动肠模型,通过使用多通道、计算机控制的气动泵同时实现了肠道微系统的流体流动和蠕动,考察了蠕动和流体流动对该装置肠上皮细胞生长和分化的影响。结果表明,微流体装置中的周期性蠕动加上流体流动显著促进了肠上皮细胞的增殖以及糖萼和微绒毛的分泌。此外,肠上皮细胞的屏障、吸收和代谢
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