疏水载体辅助液相法与固相法合成芋螺毒素的工艺对比.pdf
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1、基金项目:山东省重点研发计划(重大科技创新工程)()通信作者:姬胜利,:;郭凯,:疏水载体辅助液相法与固相法合成芋螺毒素的工艺对比张文杰,张发进赵仕法董玉香郭凯姬胜利,润辉生物技术(威海)有限公司山东 威海 ;滨州医学院药学院山东 烟台 【摘要】目的对芋螺毒素 的三种二硫键异构体进行合成工艺研究及表征鉴定。方法通过可溶性疏水载体辅助液相合成法()和固相多肽合成法()人工合成 的三种二硫键异构体的线性肽,采用三步氧化法对线性肽进行氧化折叠,获得三种折叠肽异构体(、和 ),并对两种合成工艺进行物料消耗量、“三废”产生量、收率进行对比。结果成功合成芋螺毒素异构体并进行了质谱表征;采用 法和 法合成
2、、平均收率为 、和 、;采用 法和 法合成 、物料平均消耗量为 、和 、,平均废液产生量分别为 、和 、。法和 法比较差异均有统计学意义()。结论通过对芋螺毒素 异构体的合成研究,表明 法的总体收率比 法收率高且物料消耗量及“三废”产生量少,因此 法具有重大的研究意义和商业价值。【关键词】多肽;可溶性疏水载体辅助液相合成法;固相多肽合成法;【中图分类号】【文献标志码】【文章编号】():,(),;,【】,()()(,),;,;,(),【】;芋螺毒素(,)是来源于海洋芋螺()毒液的一类活性多肽,所以又被称为芋螺多肽 。大多数芋螺多肽富含二硫键,具有特定的分子构型,能选择性地作用于细胞膜上特异的离滨
3、州医学院学报 年 月第 卷第 期 ,子通道和受体等,因此具有多种生物学效应 。芋螺含有 万种以上天然多肽类化合物,但迄今为止仅百余种多肽化合物被发现,因此,芋螺毒素具有很大的开发应用潜力 。芋螺多肽具有很强的生物活性,主要是因为芋螺多肽可以作用于离子通道 。其中钠离子通道广泛存在于神经细胞、骨骼肌细胞等可兴奋细胞的细胞膜上,在动作电位的发生和传导过程中起着关键作用 。钠通道广泛分布于各种组织和器官中,参与多种生理过程,其功能的异常会导致多种疾病的发生,如疼痛、癫痫、心脏传导病、周期性麻痹等。因此,合成针对钠离子通道的芋螺毒素有助于多种疾病的治疗和新型药物的开发 。目前,芋螺毒素的合成主要通过固
4、相法合成,虽然操作简单,但这种合成方法不仅耗费大量原料,成本高,而且粗产物产率低,纯度低 。最近报道了一种可溶性疏水载体辅助液相合成方法 ,其原理与固相合成法相似,氨基酸通过亲核取代反应与疏水性载体连接,其结合了液相法和固相法的各自优点 。此外,疏水性载体 在非极性溶液中有良好的溶解性,因此氨基酸的偶联与 的脱保护都是均相反应,可通过薄层色谱()等常用分析方法进行监测反应 。本研究通过固相法和可溶性疏水载体辅助液相法合成芋螺毒素来探究两种合成方法的差异。仪器与试剂 仪器智能磁力搅拌器()购于上海越众有限公司;高效液相色谱仪()、质谱仪()购于美国 有限公司;旋转蒸发仪()购于上海爱朗有限公司;
5、电热鼓风干燥箱()购于天津泰斯特仪器有限公司;真空冷冻干燥机()购于青岛永合创信电子科技有限公司。试剂二氯甲烷()、乙腈购于旺通化工有限公司;羟基苯并三唑()、氨基酸、二异丙基碳二亚胺()、二甲氨基吡啶()均购于苏州昊帆生物股份有限公司;,三羟基苯甲醛购于麦克林生化科技有限公司;三异丙基硅烷()购于湖北永阔有限公司;,二甲基甲酰胺()购于鲁西化工基团股份有限公司;树脂购于上海联迈生物工程有限公司。方法 法 线性肽的合成芋螺毒素的合成首先采用传统的 保护的固相多肽合成法合成 。树脂采用可酰胺化的 树脂,首先对树脂进行活化,称取 树脂 于反应容器中,用 洗涤树脂三次,于室温、无水条件下加入 溶液溶
6、胀 。用 ,二羟基茚 ,二酮对树脂进行检测,如果溶液无色,则进行下一步反应。脱除 保护基团,用 量筒量取哌啶 (树脂与哌啶质量体积比为 )加入已溶胀的树脂溶液中,震荡反应 。反应结束后,将溶液进行抽滤,弃去滤液得到滤饼,并依次使用 、冲洗,抽干以完全脱除 保护基,随即将抽干的树脂转移至反应容器中,再次加入 溶液 溶胀 。然后进行肽链的延伸,使用电子分析天平称取 (,)()、(,)、(,),加入烧杯中用 搅拌溶清,倒入反应容器中,补加适量的 在室温下反应。反应完成后,用 ,二羟基茚 ,二酮对树脂进行检测,如果溶液无色,则进行下一步反应。再次脱除 保护基团,加入含 哌啶的 溶液,震荡反应 。反应结
7、束后,将溶液进行抽滤,弃去滤液得到滤饼,并依次使用 、冲洗,抽干以完全脱除 保护基,随即将抽干的树脂转移至反应容器中,重新加入 溶液溶胀 ,溶胀完成后,称取 (,)()、(,)、(,)置于烧杯中用 活化溶解,然后倒入反应容器中,补加入 在室温下条件反应。按上述步骤继续检验、洗涤溶胀并依次缩合 ()、()、()、()、()、()、()、()、()、()、()、()、()、()、。最终合成得到 线性肽 ()()()()()()()()()()()()()()()(),最后用 滨州医学院学报 年 月第 卷第 期 ,甲醇溶液洗涤收缩树脂三次,每次 ,晾干,称重。收率为 。制备流程如图 所示。按相同方法
8、合成带保护的线性肽 和 。图 法合成 线性肽示意图 多肽氧化折叠 、和 都含有三对不同的二硫键,因此采用三步氧化法对其氧化折叠 。根据预期的二硫键连接次序,用 、和 基团保护半胱氨酸。首先对带保护的线性肽 进行裂解并脱保护处理,称取带保护的线性肽 (,)置于反应容器中,加入 三氟乙酸(,)在室温下搅拌裂解 。反应完成后,缓慢倒入到 甲基叔丁基醚中,瞬间有大量白色固体析出,搅拌 。抽滤得到白色固体,冷冻干燥。将线性肽溶解于 异丙醇溶液中,用氢氧化钠调节 到 ,并在空气中摇动使其持续氧化反应 。在从树脂裂解肽的过程中,()被脱保护,两个未保护的半胱氨酸残基随后进行自然氧化以形成第一个二硫键,并通过
9、碘乙酰胺()衍生化确认第一个桥的形成。反应完成后将肽冷冻干燥,用于第二次氧化反应。在第二次氧化过程中,保护的半胱氨酸被脱保护,然后被碘催化形成第二个二硫键。将肽溶解于 异丙醇、水、盐酸混合液()中。向溶液中加入 的 碘溶液,在室温下搅拌反应 ,通过 和 监测氧化反应并经碘乙酰胺()衍生化实验确定第二个二硫键的形成。然后逐滴加入 的抗坏血酸来终止反应,使反应体系澄清。冷冻干燥反应混合物,并使用干燥粉末进行第三次氧化。将肽溶解在 、苯甲醚()的混合溶液中,在室温条件下搅拌反应 。通过碘乙酰胺()衍生化确定第三对二硫键的形成。反应完成后抽滤,滤液经旋蒸浓缩,加入冰乙醚沉淀,离心并加入乙醚洗涤沉淀次,
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