水飞蓟素磷脂复合物的制备及体外溶出行为评价.pdf

论著 水飞蓟素磷脂复合物的制备及体外溶出行为评价曾棋平1，刘建清2，杨丽娜3，刘志宏4，宋洪涛4（1.福建医科大学附属漳州市医院药学部,福建 漳州 363000；2.泉州医学高等专科学校,福建 泉州 362000；3.联勤保障部队第九九医院药剂科,福建 漳州 363000；4.联勤保障部队第九医院药剂科,福建 福州 350025）摘要目的将水飞蓟素和磷脂复合以研制水飞蓟素磷脂复合物（silymarin phospholipids complex，SM-PC），并考察其基本理化性质。方法采用溶剂挥发法制备 SM-PC。通过前期的单因素考察，选择脂药比、药物浓度以及反应温度作为星点设计-效应面法的考察因素，以 SM-PC 的复合率为衡量指标筛选最佳研制工艺，并测定 SM-PC 的体外溶出度。结果SM-PC 的最优制备条件如下：以丙酮为反应溶剂，水飞蓟素与大豆卵磷脂的比例为 11.8，反应温度 56，反应物的浓度8.0 mg/ml。在此条件下制备 3 批样品得到 SM-PC 的复合率为（95.151.55）%，偏差1.5，结果见图 1。051015202530354045时间(t/min)01236745123674551015202530354045时间(t/min)051015202530354045时间(t/min)ABC图 1SM-PC 溶出度测定 HPLC 图A.空白辅料；B.对照品溶液；C.供试品溶液;1.TF；2.SC；3.SD；4-5.SB；6-7.ISB 2.2.2 对照品溶液的制备分别取 TF、SC、SD、SB 和 ISB 对照品适量，用分析天平精密称定，置于 100 ml 量瓶中，加甲醇轻微振摇使溶解，并稀释至刻度，得浓度为75.0、80.2、药学实践与服务2024 年 3 月 25 日第 42 卷第 3 期 102Journal of Pharmaceutical Practice and Service，Vol.42，No.3，March 25，2024 74.5、168.0、93.2 g/ml 的混合对照品溶液，保存备用。2.2.3 供试品溶液的制备取 SM-PC 适量（含水飞蓟素约 20 mg），精密称定，置 100 ml 量瓶中，加甲醇轻微振摇使溶解，加 65%甲醇稀释至刻度，摇匀，0.45 m 微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。2.2.4 线性关系及方法学考察精密量取对照品混合液 0.2、0.4、0.8、1.6、2.0、2.4、4.0 ml 于 10 ml 量瓶中，加 65%甲醇稀释至刻度，配制成 TF 浓度为 1.5、3.0、6.0、12.0、15.0、18.0、30.0 g/ml；SC 浓度为 1.6、3.2、6.4、12.8、16.0、19.2、32.1 g/ml；SD 浓度为 1.5、3.0、6.0、11.9、14.9、17.9、29.8 g/ml；SB 浓度为 3.4、6.7、13.4、26.9、33.6、40.3、67.2 g/ml；ISB 浓度为1.9、3.7、7.5、14.9、18.6、22.4、37.3 g/ml 的混合对照品溶液，取混合对照品溶液 20 l 进样，计算峰面积。以进样浓度 X（g/ml）为横坐标，峰面积Y 为纵坐标，经线性回归得回归方程，结果见表 1。表1水飞蓟素 5 种有效成分的线性方程 有效成分线性方程相关系数r线性范围（g/ml）TFY=66.273X+3.9210.999 91.530.0SCY=42.952X7.0560.999 91.632.1SDY=37.610 X+6.6860.999 81.529.8SBY=37.627X+6.6840.999 83.484.0ISBY=48.892X4.6810.999 81.937.3 取 SM-PC 适量，按“2.2.3”项下方法平行制备6 份供试品溶液，在“2.2.1”项下色谱条件进样测定，测得 TF、SC、SD、SB 和 ISB 峰面积 RSD 分别为 0.86%、1.12%、0.65%、2.13%、1.87%，表明该方法重复性良好。取同一份供试品溶液，于 0、2、4、8、12、24 h 在“2.2.1”项下色谱条件进样测定，测得 TF、SC、SD、SB 和 ISB 峰面积 RSD 为 2.21%、0.98%、1.57%、2.76%、2.12%，表明溶液在 24 h 内稳定性良好。取“2.2.2”项下混合对照品溶液，在“2.2.1”项色谱条件下进样测定 6 次，测得 TF、SC、SD、SB 和 ISB 峰面积 RSD 分别为 0.88%、0.62%、0.78%、1.05%、0.93%，表明仪器精密度良好。回收率试验结果表明，TF、SC、SD、SB 和 ISB 的平均加样 回 收 率 分 别 为 100.55%、99.64%、100.51%、100.13%、104.63%，RSD 分 别 为 0.95%、0.68%、1.15%、1.22%、1.05%。2.3 SM-PC 处方筛选的单因素考察 2.3.1 反应溶剂的影响固体药物载体比 12，反应温度 40，反应时间 1 h，药物浓度为 10 mg/ml，考察反应溶剂为无水乙醇、丙酮、甲醇时药物的复合率，结果见表 2。表2溶剂对复合率的影响(n=3)溶剂介电常数复合率（%）无水乙醇26.871.52.3丙酮19.575.62.0甲醇33.265.80.8以丙酮为反应溶剂的复合率高于无水乙醇和甲醇，这可能是由于乙醇和甲醇均为质子性溶剂，不利于磷脂复合物的形成。2.3.2 反应时间的影响固定反应溶剂为丙酮，药物载体比 12、反应温度 40，药物浓度为 10 mg/ml，考察反应时间为 0.5、1、2、3 h 时药物的复合率，结果见表 3。表3反应时间对复合率的影响(n=3)反应时间（t/h）复合率（%）0.546.11.0176.41.4285.11.2386.60.5487.31.2 试验表明，随着反应时间的延长，则复合率也增大，当反应时间大于2 h 后，复合率受时间影响较小。2.3.3 反应温度的影响固定反应时间为 2 h，反应溶剂为丙酮，药物载体比 12，药物浓度为 10 mg/ml，考察磷脂复合物制备温度在 30、40、50 和 60 时的复合率，结果见表 4。试验表明，随着反应温度的升高，复合率也增大，在 60 时，复合率达到最高，考虑到磷脂在 60 以上时容易变性，因此未做更高温度的考察。2.3.4 药物浓度的影响固定反应温度为 60，反应溶剂为丙酮，反应 药学实践与服务2024 年 3 月 25 日第 42 卷第 3 期 Journal of Pharmaceutical Practice and Service，Vol.42，No.3，March 25，2024103 时间为 2 h，药物载体比 12，考察药物浓度为 5、10、20、30 mg/ml 的复合率，结果见表 5。表5药物浓度对复合率的影响(n=3)药物浓度（B/mgml1）复合率（%）592.51.21091.52.22088.70.83075.81.3 从上表可见，药物浓度对药物的复合率有一定的影响，随着药物浓度的增加，水飞蓟素磷脂复合物的复合率降低。2.3.5 水飞蓟素与大豆磷脂的比例固定药物浓度为 10 mg/ml，反应温度为 60，反应溶剂为丙酮，反应时间为 2 h，考察水飞蓟素原料药与大豆磷脂的比例分别为 10.5，11，11.5，12，12.5 时药物的复合率，结果见表 6。表6反应物投料比例对复合率的影响(n=3)药物载体比（g/g）复合率（%）外观10.557.11.2松脆1183.02.2松脆11.587.50.7松脆1292.21.2松脆12.593.51.8黏稠 由上表可以看出，随着磷脂用量的升高，复合率也增大，原因可能为磷脂的量增大，对水飞蓟素的增溶作用也增大，溶液分子间碰撞形成复合物的几率增大，但试验中我们发现，磷脂比例为 12.5时形成的复合物较黏稠，不易干燥，故选用药物载体比为 12。2.3.6 磷脂的种类固定反应温度为 60，反应溶剂为丙酮，反应时间为 2 h，药物浓度为 10 mg/ml，水飞蓟素与磷脂的比例为 1:2，考察载体采用蛋黄卵磷脂和大豆卵磷时对复合率的影响，结果见表 7。由上表可以看出，采用大豆卵磷脂和蛋黄卵磷脂作为载体时，其复合率并没有显著区别，但采用蛋黄卵磷脂制备得到的 SM-PC 较为黏稠，不易干燥，因此选用大豆卵磷脂作为复合载体。2.4 星点设计-效应面法优化处方 2.4.1 试验设计在单因素考察的基础上，选择对复合率影响较大的几个因素为自变量，即脂药比（X1）、反应浓度（X2）、反应温度（X3），以复合率（Y1）为因变量，采用三因素、五水平的星点试验设计，各因素的水平代码和具体的试验操作值见表 8，具体的试验安排见表 9。表8各因素水平代码及试验操作值 因素1.68210+1+1.682脂药比11.201.51.802药物浓度（B/mgml1）58.0412.516.9620反应温度（T/）4044.0550.055.9560 表9试验设计及测定结果(n=3)序号X1X2X3Y111.208.0444.0575.43.021.808.0444.0585.21.931.2016.9644.0576.91.941.8016.9644.0581.41.251.208.0455.9581.81.861.808.0455.9593.51.971.2016.9655.9580.91.981.8016.9655.9583.72.391.0012.5050.0079.62.2102.0012.5050.0086.71.9111.505.0050.0086.81.8121.5020.0050.0080.71.9131.5012.5040.0078.61.8141.5012.5060.0091.92.2151.5012.5050.0084.21.8161.5012.5050.0084.11.8171.5012.5050.0084.42.5181.5012.5050.0085.73.1191.5012.5050.0085.30.8201.5012.5050.0084.51.2 2.4.2 模型拟合根据试验结果，应用 SPSS 16.0 统计软件，以评 表4反应温度对复合率的影响(n=3)温度（T/）复合率（%）3068.20.84086.72.25090.80.86092.41.3 表7磷脂种类对复合率的影响(n=3)磷脂种类磷磷脂酰胆碱含量（%）复合率（%）外观大豆卵磷脂7091.80.3松脆蛋黄卵磷脂7092.20.2黏稠 药学实践与服务2024 年 3 月 25 日第 42 卷第 3 期 104Journal of Pharmaceutical Practice and Service，Vol.42，No.3，March 25，2024 价指标（复合率）分别对各因素进行多元线性回归和二项式方程拟合，对二项式方程中的各系数进行 t 检验，删除 P0.2 的项，以达到简化模型的目的。所得多元线性回归方程如下：Y=46.584 6+10.034 2X10.381 9X2+0.534 1X3（r=0.892 1），二项式方程如下：Y=75.360 3+2.925 1X1+0.530 3X20.823 9X30.396 0X1X2+0.712 5 X1X3+7.039 1X2X37.180 2X120.021 2 X22+2.845 9X32（r=0.965 0）。由以上方程可知，二项式方程拟合的回归系数 r 高于多元线性回归，故选择二项式拟合模型进行预测。2.4.3 效应面优化与预测由“2.4.2”项下所得二项式方程，应用 DesignExpert 8.0 软件绘制指标（复合率）与影响显著的两个自变量的三维效应面和二维等高图（另一个自变量设为中心点值），结果见图 2、图 3 和图 4。脂药比90888684828016.9614.7312.5010.278.041.201.301.401.501.601.701.80脂药比16.9614.7312.5010.278.041.201.301.401.501.601.701.80复合率(%)复合率(%)药物浓度(B/mgml1)药物浓度(B/mgml1)图 2复合率对脂药比和药物浓度的三维效应面和二维等高线 反应温度(T/)脂药比复合率(%)9088868482807876复合率(%)55.9554.2552.5550.8549.1547.4545.7544.051.201.301.401.501.601.701.80反应温度(T/)脂药比55.9552.5549.1554.2550.8547.4545.7544.051.201.301.401.501.601.701.80图 3复合率对脂药比和反应温度的三维效应面和二维等高线 由图 24 可以看出，在一定范围内，水飞蓟素与大豆卵磷脂的复合率随磷脂与水飞蓟素比例的增大而增高，随反应浓度的增高而降低，随反应温度的增高而增高。每个效应面都有其较优区域，以复合率为指标，软件给出最佳工艺是水飞蓟素与大豆卵磷脂比例为 11.8，反应温度 55.95，反应物的浓度为 8.04 mg/ml。综合考虑技术的可行性和经济的合理性，确定制备 SM-PC 的最优工艺条件为水飞蓟素与大豆卵磷脂的比例为 11.8，反应温度 56，反应物的浓度 8.0 mg/ml。2.5 优化工艺的验证将上述优选的最佳工艺制备 3 批 SM-PC 进行验证性试验，测定水飞蓟素与磷脂的复合率，将所得结果与二项式拟合方程的预测值相比较，结果见表 10。由表 10 可知，复合率的预测值和实测值的偏差小于 3%，证明试验所建立的数学模型预测性较好。药学实践与服务2024 年 3 月 25 日第 42 卷第 3 期 Journal of Pharmaceutical Practice and Service，Vol.42，No.3，March 25，2024105 2.6 体外溶出试验采用桨法测定 SM-API、SM-PC、市售水飞蓟素胶囊在蒸馏水（pH5.6）和 pH7.5 的磷酸盐缓冲液（含 0.5%SDS）中的体外溶出度，桨转速为 100 r/min，水浴温度为 37。每次取含水飞蓟素 150 mg 的磷脂复合物粉末装入胶囊，分别于 10、20、30、40、50、60 min 取样，每次 10 ml，并及时补充等温度等体积的溶出介质，用 0.45 m 微孔滤膜过滤后，取续滤液进样分析14。试验结果见图 5 和图 6。SM-API、SM-PC 和水飞蓟素胶囊在 pH5.6 的蒸馏水中溶出均不完全，SM-API 各组分的溶出显示出较大差异，其中，水溶性成分 TF 溶出最高，达 60%，而SB 溶出不到 20%。在 pH7.5 的磷酸盐缓冲液（含0.5%SDS）中，SM-API 的溶出度有了一定的提高，但仍溶出不完全，SM-PC 各组分在 60 min 的溶出接近 90%，主要成分 SB 的溶出行为与市售水飞蓟素胶囊相似，远高于原料药。3讨论在制备磷脂复合物的过程中，真空干燥必须控制一定的温度条件，温度太低，则磷脂复合物无法充分干燥，制备的磷脂复合物较黏稠，不利于后续制剂的制备；而温度太高，发现所制备的磷脂复合物颜色加深，这可能是由于大豆卵磷脂在高温条件下变性所致。结合预实验，本研究最终确定制备SM-PC 的真空干燥温度为 45。通常选择溶出度试验的溶剂应该接近生理条件，对于难溶性药物而言,可根据药物的理化性质（如溶解度数据）添加适量的表面活性剂。文献报道15，将水飞蓟素制备成磷脂复合物后，药物的脂溶性提升较大，生物利用度在人体提高了 23 倍，而水溶性提升相对不明显，其在水、人工肠液 反应温度(T/)908886848280复合率(%)55.9554.2552.5550.8549.1547.4545.7544.058.0410.2712.5014.7316.96反应温度(T/)55.9552.5549.1554.2550.8547.4545.7544.058.0410.2712.5014.7316.96复合率(%)药物浓度(B/mgml1)药物浓度(B/mgml1)图 4复合率对药物浓度和反应温度的三维效应面和二维等高线 100ATFSCSDSBISB806040200溶出度(%)0102030405060时间(t/min)100BTFSCSDSBISB806040200溶出度(%)0102030405060时间(t/min)100CTFSCSDSBISB806040200溶出度(%)0102030405060时间(t/min)图 5在蒸馏水中的溶出曲线A.SM-API；B.SM-PC；C.水飞蓟素胶囊 表10最佳工艺条件验证试验(%)批次预测值实测值偏差193.7094.851.23293.7094.121.52393.7096.482.97平均数93.7095.151.55 药学实践与服务2024 年 3 月 25 日第 42 卷第 3 期 106Journal of Pharmaceutical Practice and Service，Vol.42，No.3，March 25，2024 和人工胃液中难以完全溶出。参考市售水飞蓟素磷脂复合物制剂的溶出条件，采用溶出介质为pH7.5 的磷酸盐缓冲液（含 0.5%的 SDS），桨转数为 100 r/min16。虽然采用磷脂复合物技术有效提高了水飞蓟素的体外溶出度，但由于磷脂复合物本身具有较强的黏性，分散性较差，因而也会限制其溶出速率和溶出度提高的幅度。从本文的研究结果也可以看出，仅采用磷脂复合物技术对水飞蓟素的体外溶出度提高有限，后续可与固体分散体、微球、微丸以及自微乳给药系统等制剂新技术联合应用来进一步改善溶出行为。需要注意的是，磷脂复合物联合其它制剂新技术虽能提高其自身的分散性，加快药物的溶出，但由于采用不同制剂新技术所制备药物的微粒载药方式、释药方式和速率、粒径大小等不同，其溶出速率、跨膜方式、作用部位也可能存在差异，也会影响药物的疗效17。因此，实际研究过程中，应该基于药物自身的性质以及循证药学的证据去探索合适的制剂新技术。【参考文献】李颖,吴茵,李倩,等.水飞蓟素胶囊化学成分的 UPLC-Q-TOF-MS 快速鉴定与分析 J.中国医院药学杂志,2017,37（22）:2259-2265.1 曾棋平,黄爱文,张敏新,等.水飞蓟素多组分同步释放微孔渗透泵控释片的制备及体外释放特性研究 C.中国药学大会暨第十四届中国药师周论文集,2014,2827-2840.2 王伊宁,张甜甜,李玮萱,等.水飞蓟素的药理学研究进展 J.药学研究,2021,40（6）:397-399,405.3 ZENG Q P,LIU Z H,HUANG A W,et al.Preparation andcharacterization of silymarin synchronized-release microporousosmotic pump tabletsJ.Drug Des Devel Ther,2016,10:519-531.4 MASTRON J K,SIVEEN K S,SETHI G,et al.Silymarin andhepatocellular carcinoma:a systematic,comprehensive,andcritical reviewJ.Anticancer Drugs,2015,26（5）:475-486.5 KIM S H,CHOO G S,YOO E S,et al.Silymarin induces inhi-bition of growth and apoptosis through modulation of theMAPK signaling pathway in AGS human gastric cancer cellsJ.Oncol Rep,2019,42（5）:1904-1914.6 KUMAR J,PARK K C,AWASTHI A,et al.Silymarin extendslifespan and reduces proteotoxicity in C.elegans AlzheimersmodelJ.CNS Neurol Disord Drug Targets,2015,14（2）:295-302.7 ATAIHIRE J U,NWANGWA E K,IGWEH J C.Modulationsin anti-oxidant activities of selected gastro-intestinal tissues inalloxan-induced,silymarin treated diabetic wistar ratsJ.OJ-Gas,2019,9（5）:73-90.8 王帅,李超英,董婉.星点设计-效应面法优选丹皮酚-环糊精包合物制备工艺 J.吉林中医药,2017,37（3）:307-309,313.9 黄珊,翟秉涛,杨洁,等.根皮素磷脂复合物的制备、表征及体内外溶出行为评价 J.中草药,2021,52（18）:5543-5551.10 陈晓敏,曹伶俐,崔伟峰.鼠李素磷脂复合物的处方工艺优化、表征及体外溶出度考察 J.中国医院药学杂志,2022,42（4）:399-403.11 张留超,刘勇华.鞣花酸磷脂复合物的制备及其口服生物利用度研究 J.中成药,2021,43（7）:1685-1690.12 周永刚,魏玮.水飞蓟素-磷脂酰胆碱复合物的制备及体外溶出速率评价 J.中药材,2008,31（3）:447-449.13 孙欣荣,张敏新,杨海跃,等.水飞蓟素固体分散体的制备及5 种成分的溶出度 J.中成药,2018,40（1）:87-92.14 王启帅,李二永,孙艳,等.口服固体制剂溶出方法的开发与展望 J.抗感染药学,2019,16（12）:2025-2029.15 任晓文,徐为人,连潇嫣,等.水飞蓟宾卵磷脂分散体胶囊剂溶出度测定方法的研究 J.天津中医药,2004,21（1）:65-67.16 郝海军,张红芹,贾幼智,等.采用制剂新技术提高中药磷脂复合物的溶出度和生物利用度研究进展 J.中草药,2013,44（17）:2474-2479.17收稿日期 2022-06-13 修回日期 2022-11-20本文编辑 李睿旻 100ATFSCSDSBISB806040200溶出度(%)0102030405060时间(t/min)100BTFSCSDSBISB806040200溶出度(%)0102030405060时间(t/min)100CTFSCSDSBISB806040200溶出度(%)0102030405060时间(t/min)图 6在 pH7.5 的磷酸盐缓冲液(含 0.5%SDS)中的溶出曲线A.SM-API；B.SM-PC；C.水飞蓟素胶囊 药学实践与服务2024 年 3 月 25 日第 42 卷第 3 期 Journal of Pharmaceutical Practice and Service，Vol.42，No.3，March 25，2024107