人参皂苷Rk1改善认知障碍小鼠学习记忆作用及机制.pdf
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1、中文科技期刊数据库(全文版)医药卫生 收稿日期:2023 年 12 月 21 日 作者简介:沈佳伟(1986),男,汉族,上海人,本科,主管药师,研究方向为中药药事管理。-184-人参皂苷 Rk1 改善认知障碍小鼠学习记忆作用及机制 沈佳伟 上海市闵行区中西医结合医院药剂科,上海 200241 摘要:摘要:目的 观察人参皂苷 Rk1 对记忆损伤模型小鼠改善认知障碍和对学习记忆的影响,并探讨其作用机制。方法 通过腹腔注射东莨菪碱诱导记忆损伤小鼠模型,采用 morris 水迷宫测定不同剂量人参皂苷 Rk1 对记忆损伤模型小鼠运动轨迹的影响;通过测定小鼠皮层和海马中生化指标,评价人参皂苷 Rk1 对
2、中枢神经系统的影响。结果C57BL/6 小鼠腹腔注射东莨菪碱后,小鼠血浆和皮层中多种神经递质的含量变化异常。给药人参皂苷 Rk1 后,小鼠血浆中 5-HT、Ach、GABA,L-Trp 和 L-phe 的含量明显升高,Ch、L-Glu 和 5-HIAA 的含量明显降低。小鼠皮层中 Ach、GABA、L-Trp、L-Phe 和 L-Tyr 的含量明显降低,5-HIAA、Ch、L-Glu 的含量明显升高,能够使多种变化异常的神经递质恢复稳态。结论 人参皂苷 Rk1 能够显著改善东莨菪碱诱导的记忆损伤小鼠的学习记忆功能,其作用机制可能 与调控小鼠血浆和皮层组织中多种生化指标有关,提示人参皂苷 Rk1
3、 是一种有效的用于缓解老年痴呆症状的化合物。关键词:关键词:人参皂苷 Rk1;东莨宕碱;记忆损伤小鼠;生化指标;皮层 中图分类号:中图分类号:R28 Effect of ginsenoside Rk1 on learning and memory in mice with cognitive impairment and its mechanism SHEN Jiawei Shanghai Minhang District Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western MedicinePharmacy department,Sha
4、nghai 200241 Abstract:Objective To observe the effects of ginsenoside Rk1 on improving cognitive impairment and learning and memory in memory impairment mice,and to explore its mechanism.Methods Memory impairment model mice was induced by intraperitoneal injection of scopolamine.Morris maze was used
5、 to determine the effects of different doses of ginsenoside Rk1 on the motor trajectory of the mice.The effects of ginsenoside Rk1 on the central nervous system were evaluated by measuring the biochemical indices in the cortex and hippocampus of mice.Results The contents of various neurotransmitters
6、 in plasma and cortex of C57BL/6 mice were abnormal after intraperitoneal injection of scopolamine.After the administration of ginsenoside Rk1,the contents of 5-HT,Ach,GABA,L-Trp and L-phe in the plasma were significantly increased,while the contents of Ch,L-Glu and 5-HIAA were significantly decreas
7、ed.The contents of Ach,GABA,L-Trp,L-Phe and L-Tyr in the cortex of mice were significantly decreased,while the contents of 5-HIAA,Ch and L-Glu were significantly increased,which could restore the homeostast of various neurotransmitters with abnormal changes.Conclusion Ginsenoside Rk1 can significant
8、ly improve the learning and memory function of scopolamine induced memory impairment mice,and its mechanism may be related to the regulation of a variety of biochemical indexes in mouse plasma and cortical tissue,suggesting that ginsenoside Rk1 is an effective compound for alleviating the symptoms o
9、f Alzheimers disease.Key words:ginsenoside Rk1;Dongranabidine;Mice with memory impairment;Biochemical index;cortex 中文科技期刊数据库(全文版)医药卫生-185-阿尔兹海默症是进行性认知障碍的神经退行性疾病,严重影响老年人的记忆功能和日常生活,近年来发病率有升高和年轻化的趋势。对其发病机制的研究认为 A 沉积诱导的炎症反应、氧化应激反应及兴奋性氨基酸等在阿尔兹海默疾病的发病与防治中占有重要地位1-3。研究表明阿尔兹海默症患者脑内的 A 既可直接杀伤神经细胞,又能通过激活胶质细胞释放
10、促炎症因子,促发相关信号通路,导致神经细胞受损4。此外,胶质细胞激活后,通过释放氧化应激因子,引起氧化应激反应,对相邻的神经细胞产生毒性作用。同时,促炎症因子及氧化应激因子又可以进一步导致A 沉积,从而形成恶行循环5。临床上用于治疗阿尔兹海默症的一线药物只能缓解患者症状,不能逆转疾病进程,同时伴有多种毒副作用2,3。因此,开发毒副作用小的抗阿尔兹海默症药物是十分有必要的。三七茎叶皂苷是从中药三七的茎叶部位中提取的有效部位,含有丰富的原人参二醇型皂苷,近年来关于原人参二醇型皂苷用于治疗阿尔兹海默症的报道很多6-8。茎叶提取的有效部位入药的七叶神安片对中枢系统有镇静安神的作用,表明三七茎叶皂苷能够
11、作用于中枢神经系统,有应用于治疗老年痴呆的潜力9。人参皂苷 Rk1 是从蒸制三七茎叶皂苷中分离得到的次级皂苷10,被证明有多种药理活性。人参皂苷 Rk1 还能够减少诱导型一氧化氮合酶、TNF-、环氧化酶-2 mRNA的表达,抑制一氧化氮的生成及 TNF-的分泌,缓解脂多糖诱导的炎症反应11-13,从而改善记忆损伤模型大鼠的学习记忆能力。本次研究中采用腹腔注射东莨菪碱诱导记忆损伤模型小鼠模型,用水迷宫测试对其行为学进行研究,并对血浆和皮层中的多种生化指标进行测定,评价人参皂苷Rk1对记忆损伤模型小鼠学习记忆能力的影响,并对其潜在的作用机制进行研究,旨在为三七茎叶皂苷的综合开发利用提供依据。1 实
12、验材料和方法 1.1 仪器与试剂 Morris 水迷宫(上海移数信息科技有限公司,中国);SK1200H 型超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司,中国);Milli-Q 纯水仪(Millipore,Bedford,MA,USA);BP211D 精密电子天平(Sartorius,Germany);S0200-230V 涡旋混合仪(深圳市赛泰克生物科技有限公司,中国);DK-S24 型电热恒温水浴锅(上海精宏实验设备有限公司,中国);海尔 BC/BD-519HEK-20C电冰柜(青岛海尔股份有限公司,中国);SANYO MDF-U73V 超低温冰箱(Sanyo Electric Co.,Ltd.
13、,Japan)。1.2 试剂 人参皂苷 Rk1 购自成都普瑞法(成都,中国);石杉碱甲(HA)购自上海融禾医药科技发展有限公司(上海,中国);盐酸多奈哌齐(Don)购自东京化成工业株式会社(东京,日本);氢溴酸东莨菪碱购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司(上海,中国);碘化胆碱(Ch)、氯化乙酰胆碱(Ach)、-氨基丁酸(GABA)和 L-谷氨酸(L-Glu)购自 Sigma Aldrich 公司(St.Louis,MO);5-羟色胺盐酸盐(5-HT)、5-羟基吲哚乙酸(5-HIAA),L-苯丙氨酸(L-Phe)和 L-络氨酸(L-Tyr)购自上海源叶生物科技有限公司(上海,中国);茶碱(The
14、o)购自中国药品生物制品鉴定所(北京,中国);L-色氨酸(L-Trp)和牛血清白蛋白购自大连美仑生物技术有限公司(大连,中国);色谱级甲醇、乙腈、甲酸购自 Fisher 公司(Fair lawn,NJ,USA);超纯水通过 Milli-Q 纯水仪制备。其它试剂均为分析级,购自国药集团化学试剂有限公司(上海,中国)。2 实验方法 2.1 实验动物 清洁级雄性 C57BL/6 小鼠(252 g),实验动物许可证号为 SCXK(沪)2017-0004,购自上海斯莱克实验动物有限公司,适应性饲养 7 天。实验方案符合实验动物伦理委员会的指导要求和动物福利的指导原则。2.2 给药溶液配制 称取 CMC-
15、Na 粉末 2.5 g,均匀撒在 500 mL 的超纯水表面,静置过夜,使其充分溶胀即得 0.5%CMC-Na溶液,4C 保存备用。分别称取 HA、Don 和人参皂苷Rk1 粉末约 10 mg,加入 0.5%CMC-Na 溶液,制备成 0.02 mg/mL 的 HA 给药溶液,0.5 mg/mL 的 Don 给药溶液。2.3 动物分组及给药 100 只雄性 C57BL/6 小鼠(5 周龄),随机分为 7组,分别为空白对照组,模型组,HA 组(0.2 mg/kg),中文科技期刊数据库(全文版)医药卫生-186-Don 组(5 mg/kg),人参皂苷 Rk1 低剂量(Rk1-L,0.5 mg/kg
16、),人参皂苷 Rk1 中剂量(Rk1-M,1 mg/kg),人参皂苷 Rk1 高剂量(Rk1-H,2 mg/kg)。空白对照组和模型组给予等体积的空白溶剂,其余各组分别给予对应剂量的药物预保护 7 天。从第 8 天开始,给药 30 min后,空白对照组腹腔注射生理盐水,其余各组腹腔注射东莨宕碱(1 mg/kg)。第 8 天进行适应性训练,第 9天进行可视平台实验,第10-14天进行定位航行实验,第 15 天进行空间探索实验。第 16 天,腹腔注射东莨宕碱 30 min 后处死动物,收集小鼠血浆和脑组织。2.4 Morris 水迷宫实验 Morris 水迷宫实验方法参考报道的方法14。在符合实验
17、要求的房间内,水温调节至 222C,加入二氧化钛着色剂调节水的背景使其接近平台颜色。设置水池运动区域,站台区域和二值化阈值等。水迷宫分为SE、NE、SW 和 NW 四个象限。一个直接为 9 cm 的白色圆形平台被放置在 SW 象限的中心位置。在水迷宫内测安装圆形,三角形,正方形和星形参考物。水迷宫实验装置放置完成后进行第一阶段:适应性训练。设置好仪器参数后,拿掉平台。在腹腔注射东莨宕碱 30 min 后,把小鼠面朝池壁并距水面 5 cm处放入水池中。让其在水中自主活动 60 s 后取出,擦干小鼠身上的水后,放入干燥的老鼠笼中,每只老鼠训练一次。可视平台实验为水迷宫实验的第二阶段,平台被放置于水
18、迷宫 SW 象限的中间并比水平面高出 1 cm。每只老鼠训练 3 次,入水点依次为 NE,SE,NW。若小鼠在 60 s 内上平台,让其在平台停留 15 s;若小鼠在60 s 内未找到平台,则要把小鼠引导至平台,同样让其停留 15 s。定位航行实验为水迷宫实验的第三阶段,平台被放置于水迷宫 SW 象限的中间并比水平面低 1 cm。每只老鼠训练 3 次,入水点依次为 NE,SE,NW,连续训练5 天。若小鼠在 60 s 内上平台,让其在平台停留 15 s;若小鼠在 60 s 内未找到平台,则要把小鼠引导至平台,同样让其停留 15 s。空间探索实验为水迷宫实验的最后一个阶段,实验前撤去平台。入水点
19、为 SW。让小鼠在水池中自主活动 60 s。2.5 样品收集 完成水迷宫实验后,于次日腹腔注射东莨宕碱 30 min 后,取全血至肝素化的 1.5 mL 的离心管中,脱颈椎处死小鼠并取出脑组织。脑组织被分为左皮层,右皮层,左海马,右海马和其它。取材时,将收集好的样品放入液氮中,待取材完毕,放入-80C 冰箱中保存待用。2.6 皮层及海马中相关生化指标的测定 对小鼠皮层组织称重后,加入 PBS(v:v 1:9),用高通量组织研磨仪 60 Hz 低温匀浆。然后在 4C,15,000g 的条件下离心 10 min,取上清 10%匀浆液,按试剂盒使用说明书测定 SOD、GSH-px、MDA、TNF-、
20、IL-1 和 BDNF 的含量。2.7 血浆和皮层中神经递质的测定 本次研究采用报道的经过验证的 UHPLC-MS/MS 方法15对各组小鼠血浆及皮层中的神经递质进行含量测定。样品处理方法:取 100 L 血浆样品及脑匀浆样品置于 1.5 mL 离心管中,用 200 L 含内标的乙腈溶液进行蛋白沉淀,涡旋 1 min 后 15,000 g 在 4C 离心 10 min,吸取上清 5 L 进行定量分析。3 实验结果 3.1 人参皂苷 Rk1 对获得性记忆损伤模型小鼠行为学的影响 人参皂苷 Rk1 对获得性记忆损伤模型小鼠行为学的影响结果如表 1-表 3 所示。在定位航行实验中,各组小鼠的上台潜伏
21、期及平均游泳路程均随着训练时间的延长而逐渐缩短。如表 1 和表 2 所示,在定位航行实验的第 4、5 天,模型组的平均游泳路程明显长于对照组,同时,模型组的上台时间也显著长于对照组,具有显著的统计学差异。见表 1、2。在空间探索实验中,模型组动物的穿台次数相较于对照组明显降低,差异具有统计学意义。给予阳性对照药物和不同剂量人参皂苷 Rk1 的小鼠穿台次数比模型组均有明显的增加,均与模型组的差异具有统计学意义。因此 Moris 水迷宫行为学实验表明人参皂苷Rk1 具有改善东莨菪碱诱导的记忆障碍模型小鼠的学习记忆的作用。见表 3。3.2 人参皂苷 Rk1 对小鼠皮层组织中各生化指标的影响 中文科技
22、期刊数据库(全文版)医药卫生-187-表 1 不同组别小鼠上台前游泳路径(cm)组 剂量(mg/kg)Day 1 Day 2 Day 3 Day 4 Day 5 Control/1314.24 409.20 1172.49 399.44 934.47 294.46 991.19 306.99 834.47 329.49 Model/1441.12 419.94 1344.11 409.21 1201.02 433.30#1286.66 421.92#1369.44 479.9#HA 0.2 1347.74 299.66 1244.79 344.03 1154.64 470.69 1072.49
23、 394.73*778.16 396.06*Don 5 1432.17 409.36 1359.49 437.41 1207.33 479.26 1035.43 490.09*905.70 334.63*Rk1-L 0.5 1376.76 479.67 1211.13 292.96 1115.32 400.93 1154.39 301.44 816.49 416.87*Rk1-M 1 1366.76 479.67 1244.13 292.96 1058.32 433.92*1099.39 322.15*795.49 406.55*Rk1-H 2 1395.71 432.22 1164.97 3
24、06.21 1095.29 494.46*1025.94 272.23*781.62 254.04*注:(Control,空白对照组;Model,模型组;HA,石杉碱甲组;Don,多奈哌齐组;Rk1-L、Rk1-M、Rk1-H,人参皂苷 Rk1 低、中、高剂量组;#p0.05,#p0.01,与对照组比较;*p0.05,*p0.01,与模型组比较)。表 2 不同组别小鼠上台前游泳时间(s)组 剂量(mg/kg)Day 1 Day 2 Day 3 Day 4 Day 5 Control/41.7511.68 46.7311.16 38.146.32 31.127.65 25.318.85 Mode
25、l/44.7312.93 51.2210.28 46.9814.42 39.567.57#37.2911.15#HA 0.2 43.627.96 47.0812.05 45.7713.71 37.8910.24 30.4410.37*Don 5 43.899.36 44.2910.17 43.7712.26 36.859.54 30.167.94*Rk1-L 0.5 41.5211.95 43.208.75 41.5810.99 34.378.63*27.5210.74*Rk1-M 1 43.1512.21 42.299.73 40.198.77 34.118.71*26.177.36*Rk1
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