酶免疫技术专题知识培训.pptx

酶免疫技术专题知识培训酶免疫技术专题知识培训酶免疫技术专题知识培训第1页第二节酶免疫技术分类第二节酶免疫技术分类一、均相酶免疫测定一、均相酶免疫测定二、非均相酶免疫测定二、非均相酶免疫测定第三节酶联免疫吸附试验第三节酶联免疫吸附试验一、基础原理一、基础原理二、方法类型及反应原理二、方法类型及反应原理思索题思索题小结小结酶免疫技术专题知识培训第2页放放射射免免疫疫技技术术发发光光免免疫疫技技术术酶酶免免疫疫技技术术三大经典标识技术三大经典标识技术三大经典标识技术酶免疫技术专题知识培训第3页第一节第一节 酶免疫技术特点酶免疫技术特点酶免疫技术专题知识培训第4页主要试剂主要试剂:酶标识抗体或抗原酶标识抗体或抗原酶标物特点：酶标物特点：免疫学活性免疫学活性 酶对底物催化活性酶对底物催化活性抗原抗体反应特异性抗原抗体反应特异性+酶高效催化反应专一性酶高效催化反应专一性原理及特点原理及特点酶免疫技术专题知识培训第5页特点：特点：灵敏度高、特异性强、灵敏度高、特异性强、准确性好准确性好酶标识试剂能够较长时酶标识试剂能够较长时间保持稳定间保持稳定操作简便、对环境没有操作简便、对环境没有污染。污染。易与其它技术偶联易与其它技术偶联衍生出适用范围更广新衍生出适用范围更广新方法方法。原理：原理：酶标抗体（抗原）与抗原酶标抗体（抗原）与抗原（抗体）特异性反应（抗体）特异性反应酶对底物显色反应酶对底物显色反应反抗原或抗体进行定位、反抗原或抗体进行定位、定性或定量测定分析定性或定量测定分析 原理及特点原理及特点酶免疫技术专题知识培训第6页标识酶要求：标识酶要求：活性高活性高 性质稳定性质稳定 专一性强专一性强 酶催化底物显色信号易于判断和测量酶催化底物显色信号易于判断和测量 方法敏感，重复性好，简单易行方法敏感，重复性好，简单易行 酶底物易于配制保留，酶及底物价廉酶底物易于配制保留，酶及底物价廉 一、酶和酶作用底物一、酶和酶作用底物酶免疫技术专题知识培训第7页辣根过氧化物酶（辣根过氧化物酶（HRPHRP）糖蛋白（主酶）糖蛋白（主酶）亚铁血红素（辅基）亚铁血红素（辅基）主酶与酶活性无关主酶与酶活性无关 辅基是酶活性中心辅基是酶活性中心RZRZ值：值：403nm 403nm（辅基）（辅基）与与275nm275nm（主酶）（主酶）ODOD值之比值之比 RZRZ值与酶活性无关，值与酶活性无关，酶活性单位比酶活性单位比RZRZ值值更为主要更为主要 ELISAELISA中应用最为广中应用最为广泛标识用酶泛标识用酶 常见酶常见酶酶和酶作用底物酶和酶作用底物酶免疫技术专题知识培训第8页碱性磷酸酶（碱性磷酸酶（APAP）菌源性菌源性AP AP 肠粘膜肠粘膜APAP 半乳糖苷酶（半乳糖苷酶（-Gal-Gal）用于均相酶用于均相酶免疫测定免疫测定 常见酶常见酶酶和酶作用底物酶和酶作用底物酶免疫技术专题知识培训第9页HRPHRP底物底物 DHDH2 2+H+H2 2O O2 2 D+2H D+2H2 2O O HRPHRP供氢体供氢体DHDH2 2习惯上被称为底物，底物有各种习惯上被称为底物，底物有各种 H H2 2O O2 2为受氢体，为受氢体，HRPHRP对受氢体专一性很高对受氢体专一性很高 常见底物常见底物酶和酶作用底物酶和酶作用底物酶免疫技术专题知识培训第10页HRPHRP常见底物常见底物 邻苯二胺邻苯二胺 OPDOPD四甲基联苯胺四甲基联苯胺 TMBTMB5-5-氨基水杨酸氨基水杨酸5-ASA 5-ASA 2,2-2,2-氨基氨基-二二(3-(3-乙基乙基-苯并噻苯并噻唑啉磺酸唑啉磺酸-6)-6)铵盐铵盐 ABTSABTS常见底物常见底物酶和酶作用底物酶和酶作用底物酶免疫技术专题知识培训第11页OPDOPD反应后显橙黄反应后显橙黄色，加酸终止反色，加酸终止反应后呈棕黄色，应后呈棕黄色，测定波长测定波长492nm492nm。不稳定，致癌性。不稳定，致癌性。TMBTMB反应后显蓝色反应后显蓝色 ，加酸终止反应后，加酸终止反应后变为黄色变为黄色,测定波长测定波长450nm 450nm，稳定，无，稳定，无致癌性，致癌性，ELISAELISA中应中应用最广泛底物。用最广泛底物。HRPHRP常见底物常见底物 酶和酶作用底物酶和酶作用底物酶免疫技术专题知识培训第12页APAP底物底物-Gal-Gal底物底物 对对-硝基苯磷酸酯（硝基苯磷酸酯（pNPP pNPP）4-4-甲基伞酮基甲基伞酮基-D-D半半-乳糖苷（乳糖苷（4MUG 4MUG）经经APAP作用后产物为黄色对硝作用后产物为黄色对硝基酚，最大吸收峰波长为基酚，最大吸收峰波长为405 405 nmnm。酶作用后，生成高强度酶作用后，生成高强度荧光物荧光物 ，用荧光计，用荧光计 测测量。量。常见底物常见底物酶和酶作用底物酶和酶作用底物酶免疫技术专题知识培训第13页酶免疫技术关键组成个别酶免疫技术关键组成个别 酶结合物酶结合物（conjugateconjugate）酶标识物酶标识物 经过化学反应或免经过化学反应或免疫学反应，让酶与疫学反应，让酶与抗体或抗原形成抗体或抗原形成结合物结合物 二、酶标识抗体或抗原二、酶标识抗体或抗原酶免疫技术专题知识培训第14页抗原要求纯度高，抗原性完整抗原要求纯度高，抗原性完整 抗体需要特异性好、效价高、亲抗体需要特异性好、效价高、亲协力强以及比活性较高，能批量生协力强以及比活性较高，能批量生产，易纯化。产，易纯化。制备方法要求制备方法要求酶标识抗体或抗原酶标识抗体或抗原酶免疫技术专题知识培训第15页制备方法要求制备方法要求技术方法简单、产率高，重复性技术方法简单、产率高，重复性好好标识反应不影响酶和抗原或抗体标识反应不影响酶和抗原或抗体活性活性酶标识物稳定酶标识物稳定 ，不形成聚合物，不形成聚合物酶标识抗体或抗原酶标识抗体或抗原酶免疫技术专题知识培训第16页制备方法制备方法过碘酸钠法（直接法）过碘酸钠法（直接法）常见于常见于HRPHRP标识抗体或抗原标识抗体或抗原 戊二醛交联法戊二醛交联法酶标识抗体或抗原酶标识抗体或抗原酶免疫技术专题知识培训第17页戊二醛交联法戊二醛交联法戊二醛分子中有两个相同醛基，可分别与戊二醛分子中有两个相同醛基，可分别与HRPHRP和蛋白质分子中氨基结合。该法有一和蛋白质分子中氨基结合。该法有一步法和二步法。二步法标识效率比一步法步法和二步法。二步法标识效率比一步法高，酶标识物质量较均一。高，酶标识物质量较均一。酶标识抗体或抗原酶标识抗体或抗原酶免疫技术专题知识培训第18页纯化及判定纯化及判定标识完成后应除去反应液中游离酶、标识完成后应除去反应液中游离酶、游离抗体或抗原、酶聚合物以及抗体游离抗体或抗原、酶聚合物以及抗体或抗原聚合物，防止游离酶增加非特或抗原聚合物，防止游离酶增加非特异显色，以及游离抗体或抗原起竞争异显色，以及游离抗体或抗原起竞争作用而降低特异性染色强度作用而降低特异性染色强度 常见纯化方法：常见纯化方法：葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶G-200/G-150G-200/G-150过柱层析纯化过柱层析纯化50%50%饱和硫酸铵沉淀提纯饱和硫酸铵沉淀提纯酶标识抗体或抗原酶标识抗体或抗原酶免疫技术专题知识培训第19页固相抗体或抗原是非均相酶免技术中将固相抗体或抗原是非均相酶免技术中将游离和结合酶标识物快速分离最常见方法游离和结合酶标识物快速分离最常见方法 固相抗体或抗原就是把抗体或抗原结合固相抗体或抗原就是把抗体或抗原结合到固相载体表面到固相载体表面 三、固相载体三、固相载体酶免疫技术专题知识培训第20页要求要求 结合抗体或抗原容量大结合抗体或抗原容量大 抗体或抗原牢靠地固定在其表面抗体或抗原牢靠地固定在其表面 不影响免疫反应性不影响免疫反应性 利于反应充分进行利于反应充分进行 固相方法简便易行，快速经济固相方法简便易行，快速经济种类种类塑料制品塑料制品 微颗粒微颗粒膜载体膜载体 固相载体固相载体酶免疫技术专题知识培训第21页将抗原或抗体结合于固相载体将抗原或抗体结合于固相载体用用1%1%5%5%牛血清白蛋白或牛血清白蛋白或5%5%20%20%小牛血清消小牛血清消除固相载体表面未结合位点，消除非特异性除固相载体表面未结合位点，消除非特异性吸附吸附包被包被coatingcoating封闭封闭blockingblocking包被与封闭包被与封闭酶免疫技术专题知识培训第22页第二节酶免疫技术分类第二节酶免疫技术分类 酶免疫技术专题知识培训第23页酶酶免免疫疫技技术术酶免疫组化酶免疫组化酶免疫测定酶免疫测定均均 相相非均相非均相固相酶免疫测定固相酶免疫测定液相酶免疫测定液相酶免疫测定组织切片或其它标本中抗原定位组织切片或其它标本中抗原定位 液体标本中抗原或液体标本中抗原或抗体定性和定量抗体定性和定量酶免疫技术专题知识培训第24页用于小分子激素和半抗原（如药品）测定用于小分子激素和半抗原（如药品）测定 酶标识物与对应抗原或抗体结合后，标酶标识物与对应抗原或抗体结合后，标识酶活性会发生改变，不用分离结合和游识酶活性会发生改变，不用分离结合和游离酶标识物，经过测定标识酶活性改变，离酶标识物，经过测定标识酶活性改变，而确定抗原或抗体含量。而确定抗原或抗体含量。原理原理一、均相酶免疫测定一、均相酶免疫测定酶免疫技术专题知识培训第25页最具代表性两种技术最具代表性两种技术酶放大免疫测定技术酶放大免疫测定技术EMITEMITenzyme-mutiplied immunoassay technique克隆酶供体免疫分析克隆酶供体免疫分析 CEDIACEDIAcloned enzyme donor immunoassay 均相酶免疫测定均相酶免疫测定酶免疫技术专题知识培训第26页EMITEMIT示意图示意图酶免疫技术专题知识培训第27页CEDIACEDIA示意图示意图酶免疫技术专题知识培训第28页分类：分类：液相酶免疫测定液相酶免疫测定 固相酶免疫测定固相酶免疫测定 以聚苯乙烯等材料作为固相载体酶联免疫吸附以聚苯乙烯等材料作为固相载体酶联免疫吸附试验（试验（ELISAELISA）是当前最为常见固相酶免疫测是当前最为常见固相酶免疫测定定与均相不一与均相不一样之处样之处需分离游离与结合酶标识物需分离游离与结合酶标识物二、非均相酶免疫测定二、非均相酶免疫测定酶免疫技术专题知识培训第29页第三节酶联免疫吸附试验第三节酶联免疫吸附试验 酶免疫技术专题知识培训第30页底物显色底物显色定性或定量分析定性或定量分析原理原理包被包被反应反应加入待测抗体或加入待测抗体或抗原和酶标抗原抗原和酶标抗原或抗体或抗体洗涤洗涤使结合在固相上使结合在固相上抗原抗体复合物抗原抗体复合物与未结合分离与未结合分离1234一、基础原理一、基础原理酶免疫技术专题知识培训第31页固相抗原或抗体固相抗原或抗体 酶标识物（酶结合物酶标识物（酶结合物）酶反应底物酶反应底物 三个必要试剂三个必要试剂 二、方法类型及反应原理二、方法类型及反应原理酶免疫技术专题知识培训第32页双抗体夹心法双抗体夹心法方法：方法：用已知抗体包被，加入待检血清，再加酶用已知抗体包被，加入待检血清，再加酶标抗体，加底物显色标抗体，加底物显色应用：应用：二价或二价以上较大分子抗原测定二价或二价以上较大分子抗原测定 乙型肝炎表面抗原、甲胎蛋白、乙型肝炎表面抗原、甲胎蛋白、HCGHCG等等ELISAELISA检测抗原方法检测抗原方法酶免疫技术专题知识培训第33页酶免疫技术专题知识培训第34页双抗体夹心法测抗原双抗体夹心法测抗原+-E EE EE EE EE EE EE EE EE E酶免疫技术专题知识培训第35页竞争法竞争法 方法：方法：用已知抗体包被，加入待测血清，再加酶标抗用已知抗体包被，加入待测血清，再加酶标抗原，酶标抗原与待检物竞争与包被物结合。加底物显色原，酶标抗原与待检物竞争与包被物结合。加底物显色。应用：应用：用于只有一个抗原决定簇小分子半抗原（药品、用于只有一个抗原决定簇小分子半抗原（药品、激素等）激素等）ELISAELISA检测抗原方法检测抗原方法酶免疫技术专题知识培训第36页酶免疫技术专题知识培训第37页竞争法测抗原竞争法测抗原+-E EE EE EE EE EE EE E2 2、加待检物、加待检物抗原与酶标抗抗原与酶标抗原竞争与抗体原竞争与抗体结合结合3 3、加酶作用、加酶作用底物不显色底物不显色或显色弱或显色弱3 3、加酶作用、加酶作用底物显色底物显色1 1、已知抗体包、已知抗体包被于载体表面被于载体表面1 1、已知抗体包、已知抗体包被于载体表面被于载体表面2 2、加待测物、加待测物和酶标抗原，和酶标抗原，酶标抗原与抗酶标抗原与抗体结合体结合E E酶免疫技术专题知识培训第38页间接法间接法方法方法 用已知抗原包被，加入待测血清，再加酶标抗人用已知抗原包被，加入待测血清，再加酶标抗人IgGIgG（抗抗（抗抗体或二抗）加底物显色。体或二抗）加底物显色。优点优点 一个酶标抗抗体检测各种与抗原对应抗体一个酶标抗抗体检测各种与抗原对应抗体应用应用 常见于常见于HCVHCV抗体、抗体、HIVHIV抗体和梅毒螺旋体抗体等测定抗体和梅毒螺旋体抗体等测定ELISAELISA检测抗体方法检测抗体方法酶免疫技术专题知识培训第39页酶免疫技术专题知识培训第40页间接法测抗体间接法测抗体-E EE EE EE EE EE EE EE EE E+酶免疫技术专题知识培训第41页双抗原夹心法双抗原夹心法原理：原理：类似双抗体夹心法类似双抗体夹心法操作步骤操作步骤：类似类似 应用：应用：乙型肝炎表面抗体乙型肝炎表面抗体ELISAELISA检测抗体方法检测抗体方法酶免疫技术专题知识培训第42页竞争法竞争法原理：原理：类似检测抗原竞争法类似检测抗原竞争法 应用应用：乙型肝炎病毒关键抗体乙型肝炎病毒关键抗体(HBcAb)(HBcAb)和和乙型肝炎病毒乙型肝炎病毒e e抗体抗体(HBeAb)(HBeAb)检测检测 ELISAELISA检测抗体方法检测抗体方法酶免疫技术专题知识培训第43页捕捉法捕捉法 应用：应用：病原体急性感染诊疗中病原体急性感染诊疗中IgMIgM型抗体型抗体 甲型肝炎甲型肝炎HAV-IgMHAV-IgM抗体抗体 乙型肝炎病毒关键乙型肝炎病毒关键HBc-IgMHBc-IgM抗体抗体ELISAELISA检测抗体方法检测抗体方法酶免疫技术专题知识培训第44页捕捉法捕捉法 原理：原理：抗人抗人IgMIgM链抗体包被链抗体包被捕捉待测标本中捕捉待测标本中IgMIgM类抗体类抗体加入特异性抗原和酶标识特加入特异性抗原和酶标识特异性抗原抗体异性抗原抗体 底物显色底物显色 酶免疫技术专题知识培训第45页捕捉法原理捕捉法原理+-E EE EE EE EE E 1 1、固相化抗人、固相化抗人IgMIgM1 1、固相化抗人、固相化抗人IgMIgM2 2、加待测物、加待测物特异性特异性IgMIgM与与非特异性非特异性IgMIgM和抗人和抗人IgMIgM结合结合3 3、加特异性、加特异性抗原，与特异抗原，与特异性抗体结合性抗体结合4 4、加酶标抗体、加酶标抗体与特异性抗原结与特异性抗原结合，加底物显色合，加底物显色2 2、加待测物、加待测物只有非特异性只有非特异性IgMIgM和抗人和抗人IgMIgM结合结合3 3、加特异性抗、加特异性抗原，不能与非原，不能与非特异性特异性IgMIgM结合结合4 4、加酶标抗体、加酶标抗体无抗原结合，无抗原结合，加底物不显色加底物不显色酶免疫技术专题知识培训第46页第第四四节节 酶免疫测定应用酶免疫测定应用酶免疫技术专题知识培训第47页均均相相酶酶免免疫疫测测定定主主要要用用于于药药品品和和小小分分子子物物质质检检测测。非非均均相相免免疫疫测测定定中中ELISAELISA应应用用更更为为广广泛泛，ELISAELISA广广泛泛用用于于传传染染病病诊诊疗疗，病病毒毒如如病病毒毒性性肝肝炎炎（甲甲肝肝抗抗体体、“乙乙肝肝三三对对”、丙丙肝肝抗抗体体、丁丁肝肝抗抗体体、戊戊肝肝抗抗体体）、风风疹疹病病毒毒、疱疱疹疹病病毒毒、轮轮状状病病毒毒等等；细细菌菌如如结结核核杆杆菌菌、幽幽门门螺螺杆杆菌菌等等。也也用用于于一一些些蛋蛋白白质质检检测测，如如各各种种免免疫疫球球蛋蛋白白、补补体体、肿肿瘤瘤标标志志物物（甲甲胎胎蛋蛋白白、癌癌胚胚抗抗原原、前前列列腺腺特特异性抗原等）。异性抗原等）。酶免疫技术专题知识培训第48页1 1酶免疫技术关键点？酶免疫技术关键点？2 2酶联免疫吸附试验原理（酶联免疫吸附试验原理（ELISAELISA）？）？3 3竞争法在酶联免疫检测应用中原理和应用？竞争法在酶联免疫检测应用中原理和应用？4 4常见底物有哪几类？特点？常见底物有哪几类？特点？5 5常见酶有哪几类？特点？常见酶有哪几类？特点？6 6何谓包被与封闭？其作用？何谓包被与封闭？其作用？7 7常见固相载体种类和特点？常见固相载体种类和特点？8 8举例固相酶免疫测定应用原理及影响原因。举例固相酶免疫测定应用原理及影响原因。9 9ELISAELISA非特异性干扰有哪些，其机制？非特异性干扰有哪些，其机制？1010对酶免疫技术应用评价怎样？对酶免疫技术应用评价怎样？思索题思索题酶免疫技术专题知识培训第49页