生化分析知识点总结.doc

一 氨基酸1 八种必须氨基酸的英文命名及缩写。赖氨酸 Lysine Lys K甲硫氨酸 Methionine Met M缬氨酸 valine Val V异亮氨酸 isoleucine Ile I苯丙氨酸 phenylanine Phe F亮氨酸 leucine Leu L色氨酸 tryptophan Try W苏氨酸 threonine thr T2 俩种氨基酸组成多肽时,有几种？成二肽,有四种成三肽时，有八种（仅供参考，不一定正确，有不同意见请指出来）.二 酶分析1酶活性的定义,国际常用的单位:酶活性（enzyme activity)也称为酶活力，指酶促反应速率，即规定条件下在单位时间内产物的生成量或底物的减少量。酶活性单位：表示酶的相对含量，指在一定条件下，单位时间内生成一定量的产物或消耗一定量的底物所催化的酶量。 a国际单位IU（mol/min）定义:在规定条件下(25及其他最适条件），每分钟催化1mol底物转变为产物的酶量，为1IU或1U。 1IU=1mol/min.BKatal单位（mol/s)定义：1Katal是在规定条件下，每秒钟催化1mol底物转变为产物的酶量。1Katal1mol/s。IU与Katal单位的关系：1katal = 60106IU， 1IU = 16。67nkatal3 酶促反应酶促反应的历程：延滞期，线性期，非线性期a酶促反应式：B米氏方程CKm的含义与意义Km的含义： 当Km=S时，可见Km值等于反应速率达到最大反应速率Vmax一半时的底物浓度。Km的意义：Km是酶的一个特征性常数（其他如等电点）， Km的大小只与酶的性质有关反映酶对底物亲和力的大小 选择酶的最适底物或天然底物 计算不同底物浓度时的反应程度 鉴别酶的种类 判断可逆反应的速率 判断酶偶联反应的限速反应计算工具酶的用量3.两种测定酶活性的方法:a定时法原理:定时法是固定时间法的简称，是指测定反应开始后一段时间（t1t2）产物的增加量或底物的减少量以测定酶活性的方法。该方法一般需要在反应进行到一定时间后用强酸、强碱、蛋白沉淀剂等终止反应。优点：简单、不需要保温设备、不用考虑酶的活性。缺点：如果不做预试验则无法了解其酶促反应进程（t1t2）是否为零级反应,故难以确保测定结果的准确性.b连续检测法：原理： 连续监测法是指在多个时间点连续测定产物(或底物）在线性期内的生成量(或消耗量)即零级反应速率以测定酶活性的方法，又称速率法、零级反应速率法、斜率法。该方法是在一定的反应时间区段内（至少9120s)每隔一定时间（常为230s）读取一次吸光度值，连续测定多点（至少4点），然后对吸光度数据作最小二乘法处理,再用线性期内的数据计算单位时间内的反应速率A/min，最后计算出酶活性。连续监测法的特点：属于即时观测，无需停止酶促反应、不需添加其他呈色试剂，可将多点的测定结果绘图连线，快速、直观查看酶促反应进程,很容易找到呈直线的线性期；连续监测法要求不显色而是直接测定底物（或辅助底物即中间底物）或产物量的变化，因此，可以选择紫外吸收法或生色原显色法; 能够准确地控制温度、pH值和底物浓度等，要求仪器具有恒温装置及自动监测功能，半自动及全自动生化分析仪都能满足这些要求 ;测定结果常较定时法高。4.固定化酶和游离酶的优点和缺点：a固定化酶优点：增加了酶的活性和稳定性 可回收重复使用，降低了酶耗 酶反应过程便于控制 适用于连续反应 易于反应体系分离 对环境的耐受性增强缺点：对酶的物理化学性质产生一定的影响.b游离酶优点：易溶于水 于底物的作用面积大，反应充分 活性接近生理状态缺点：难与底物分离 反应条件控制严格 不能反复利用,易失活三蛋白质分析1. 蛋白质的盐析，变性及二者的区别盐析：在蛋白质溶液中加入某些无机盐的浓溶液，使蛋白质的溶解度下降而从溶液中析出来的现象。变性:在热、重金属、酸、碱、某些有机物等作用下，蛋白质的物理性质和生理功能发生改变的现象，称为蛋白质的变性。蛋白质盐析和变性的区别与对比2。蛋白质的序列分析：测得的是蛋白质的一级结构。蛋白质的结构:一级结构：蛋白质的氨基酸残基的序列， 一级结构的作用力：肽键，SS键.二级结构:-螺旋，-折叠，转角，无规卷曲二级结构形成的力量:氢键超二级结构:若干相邻的二级结构中的构象单元彼此相互作用，形成有规则的、在空间上能辨认的二级结构组合体是球状蛋白质的折叠单位，在空间上彼此分隔,各自具有部分生物功能的结构含100200个氨基酸残基,1条长的多肽链首先折叠成几个相对独立的结构域再缔合成三级结构。三级结构：由若干二级结构单位，完全折叠后可组成一个完整的蛋白质分子，即为三级结构,可具有活性。三级结构形成的力量：氢键，离子键，疏水键， 双硫键3.蛋白质分子量的测定方法:十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳法（SDS-PAGE法）和凝胶过滤层析法。 a十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶色谱法： 基本原理：SDS可以破坏蛋白质中的疏水键和氢键，并按一定比例(1g蛋白质结合1。4g SDS）和蛋白质组成复合物,使蛋白质带的负电荷的量远远超过其本身的电荷量,并与蛋白质的分子量成正比。2-巯基乙醇破坏了蛋白质二硫键，使蛋白质呈椭圆棒形，其轴长与分子量成正比.mmq/fq/6prh，所有蛋白质的迁移率都相同.b凝胶过滤层析法： 原理：蛋白质在凝胶过滤层析柱中的洗脱体积Ve，与其分子量的关系如下式所示：lg MrK1K2 Ve在实验中,只要测得几种蛋白质分子量标准物的Ve，并以它们的lg Mr对Ve作图得一直线，再测出样品的Ve，即可从图中得到样品的分子量。俩者的联系与关系：凝胶过滤法测得的是蛋白质四级结构（如果它有的话）的分子量；SDS-PAGE测得的是蛋白质亚基的分子量；在有2-巯基乙醇（或DTT）存在时，SDS-PAGE可测得蛋白质每条多肽链的分子量。综合应用这两种方法，可得到待测蛋白质结构的许多信息。SDSPAGE与凝胶过滤法是互补的4.两种测定蛋白质的方法：a凯氏定氮法：蛋白质+硫酸CO2+H2O+NH3硫酸铵+强碱氨优点：适用样品广泛，结果可靠缺点:样品中非蛋白态氨影响测定值;蛋白质氨基酸有偏差时（大量碱性氨基酸、酰胺、小分子量氨基酸)误差较大；操作繁琐。b紫外光谱吸收法：原理：色氨酸、酪氨酸的最大吸收峰在280 nm附近。大多数蛋白质含有这两种氨基酸残基，在一定浓度范围内，蛋白质的A280与其浓度呈正比，据此可进行蛋白质定量测定。是一种快速简便分析溶液中蛋白质含量的的方法。计算方法:标准曲线法: 蛋白质浓度 (mg/ml）=1.45A280-0.74A260注意事项：石英比色杯 调零所用溶液 光密度范围四抗原抗体，全抗原和半抗原的关系1.抗原 抗原是能够引起免疫反应的分子。抗原具有以下两种特性： 免疫原性（immunogenicity）,即诱导刺激免疫系统产生抗体或者激活淋巴细胞产生免疫应答的能力，具有这种特性的物质称为免疫原(immunogen）； 抗原性（ antigenicity ) ，指能与相应抗体或致敏淋巴细胞发生特异性结合,引起免疫反应的性能。 全抗原：具有上述两种特性的物质称为完全抗原。包括：蛋白质，多糖,核酸，合成多肽,低分子物质。半抗原：不能诱导产生抗体，但能和适当抗体起反应，即有免疫反应性的简单分子称为半抗原。只具有抗原性.全抗原能引起机体的免疫反应，半抗原不能引起机体的免疫反应。2.亲和常数：免疫反应：Ag+Ab Ag-Ab该免疫反应遵循可逆生物大分子相互作用的热动力学基本原理，其反应式为式中:Ab为游离的抗体结合位点的浓度；Ag为游离的抗原结合位点的浓度;AbAg为抗原抗体复合物的浓度；k1为正反应速率常数；k2为负反应速率常数;K为反应平衡常数（亲和常数）。抗原和抗体在体内进行的反应称为免疫反应,在体外进行的反应称为血清学反应。3。酶联免疫分析法（ELISA）. 酶联免疫吸附分析法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）原理使抗原或抗体结合到某种固相载体表面；抗原或抗体与某种酶联结成酶标抗原或抗体; 在测定时，使受检标本和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相抗原或固相抗体起反应； 用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开,结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例; 加入酶反应底物，底物被酶催化为有色产物,产物量与标本中受检物的量相关，用分光光度法进行定量.酶联免疫分析法的流程以检测氯胺酮为例1 包被抗原(10和5 g/mL）2 洗涤3 加入氯胺酮抗体和氯胺酮小分子4 洗涤5 加酶标抗体-HRP标记羊抗兔IgG6 洗涤7 加底物显色、终止8 观察结果4。时间分辨荧光分析法。TRFIA所用的标记物是镧系元素螯合物，利用这类荧光物质荧光寿命长及Stokes位移大的特点，通过波长和时间两种分辨技术，有效排除了非特异本底荧光的干扰,具有灵敏度高，标记物制备简单，稳定性好，标准曲线线性范围宽，操作方便的优点.5。单克隆抗体和多克隆抗体的比较:6。设计合适的方案检测生活中的小分子有机物。五 ,核酸（DNA和RNA）1. DNA 是双螺旋结构，RNA是单链的！ DNA：A-T G-C RNA: A-U G-C2. PCR的意义和简单操作流程意义：PCR (Polymerase chain reaction） 是用一对寡聚DNA作为引物，通过加温变性退火DNA合成这一周期的多次循环,使目的DNA片段得到扩增。由于这种扩增产物是以指数形式积累的，经2530个循环后，扩增倍数可达106.流程: （一)原理双链DNA通过高温变性解离成互补单链DNA 变性 与一对寡核苷酸引物（5， 3）降低温度退火 DNA加热变性+引物慢慢冷却使其结合,形象地称为退火 适温延伸5/3引物形成新链变成4条链DNA 延伸 第二轮：变性退火延伸 呈指数增长 理论值：一轮一倍 10轮 103=1000倍 20轮 106 30 轮 109 理论 模板扩增30轮 1ng-1g 实际 模板扩增30轮 1ng-10mg模板DNA经加热至93左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP为反应原料，靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链。每完成一个循环需24分钟， 23小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍.3. DNA测序的俩种方法基本原理：a sanger双脱氧链终止法：引入了双脱氧核苷三磷酸（2，3-ddNTP)作为链终止剂;2,3ddNTP与普通的dNTP不同之处在于前者的脱氧核糖的3位又少了个羟基。它可以在DNA聚合酶的作用下和多核苷酸链的3羟基形成磷酸二酯键，但却不能再与下一个核苷酸缩合,结果使得多核苷酸链的延伸终止；在DNA的合成反应中，除了加入4种正常的dNTP外，再加入一种少量的ddNTP，反应产物是一系列的长短不一的核苷酸链。在4组独立的DNA合成反应中,分别加入4种不同的ddNTP,结果将生成4组核苷酸链,它们将分别终止于每一个A，每一个G,每一个C,每一个T的位置上。对这4组核苷酸链进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，就可读出序列。b Gillbert化学裂解法：将DNA 片段的 5端磷酸基作放射性标记,再分别采用不同的化学方法修饰和裂解特定碱基，从而产生一系列长度不一而 5 端被标记的 DNA 片段,这些以特定碱基结尾的片段群通过凝胶电泳分离，再经放射线自显影，确定各片段末端碱基,从而得出目的 DNA 的碱基序列。4. 分子印记的原理和流程: (一）Southern Blot原理：将待检测的DNA分子用/不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离,继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上,固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应。如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小.DNA 琼脂糖电泳 印迹转移 预杂交 杂交（变性探针） 洗膜 放射自显影或显色用途:检测样品中的DNA及其含量，了解基因的状态, 如是否有点突变、扩增重排等。(二)Northern Blot 原理：在变性条件下将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳,继而按照同Southern Blot相同的原理进行转膜和用探针进行杂交检测.操作过程 mRNA提取甲醛变性电泳 印迹转移 预杂交 杂交（变性探针）洗膜放射自显影或化学发光.用途：检测样品中是否含有基因的转录产物（mRNA）及其含量。六 生物大分子.1. 俩种分离纯化蛋白质的方法: a。反向高效液相色谱 蛋白质分子中既有亲水性基团（OH，NH、COOH、SH等），也有疏水性基团(如苯环、-CH3、CH2和-CH等）。不同的蛋白质在相同流动相中由于疏水基团多少、种类以及表面分布情况不同,与填料的亲合力也不同，从而得到分离。 结果：疏水性强的蛋白质亲合力大，出峰迟；疏水性小的蛋白质就容易被洗脱.其分离蛋白质和酶等生物大分子具有速度快、分离性能好，重复性好,溶剂和流动相易除去等优点。 在所有的液相色谱法中反相色谱的分离性能. 缺点是很多蛋白质或酶在分离过程中失活，而且回收的样品中总含有有机溶剂。b凝胶过滤层析亦称凝胶色谱、排阻色谱或分子筛，是利用凝胶把分子大小不同的物质分离开的一种方法。其机理是分子筛效应.在洗脱过程中，大分子不能进入凝胶内部，而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外；而小分子可以进入凝胶颗粒内部的多孔网状结构，路径长、流速慢，以至最后流出柱外。因此，混合样品如同“过筛”一样,因分子大小的不同得以彼此分开.它具有分离条件温和,产品收率高,生物活性好，分离面宽等优点,广泛用于蛋白质或多肽物质的分离纯化中.2. 核酸的分离纯化方法：a沉淀法：沉淀是浓缩核酸最常用的方法。 优点：改变核酸的溶解缓冲液； 重新调整核酸的浓度； 去除溶液中某些盐离子与杂质.当核酸溶液的pH值大于4时，核酸分子呈多聚阴离子状态，它与1价或2价阳离子形成的盐在许多有机溶剂中不溶解，也不会被有机溶剂变性。常用的盐：常用的有机溶剂：乙醇，异丙醇，聚乙二醇（PEG），c 精胺精胺不是有机溶剂，但可快速有效沉淀DNA。原理是：精胺与DNA结合后,使DNA在溶液中结构凝缩而发生沉淀,并可使单核苷酸和蛋白质杂质与DNA分开，达到纯化DNA的目的. 一般核酸沉淀在低温长时间下进行。低温长时间沉淀,易导致盐与DNA共沉淀，影响以后的实验. 一般使用0冰水，1015min， DNA样品足可达到实验要求.C聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE） 凝胶是由丙烯酰胺聚合而成;样品的电荷效应和凝胶的筛选效应是分离的主要依据；聚丙烯酰胺凝胶具有机械强度好，有弹性，透明,化学性质稳定，对pH和温度变化小，没有吸附和电渗作用小的特点，是一种很好的电泳支持介质。分类：1、变性聚丙烯酰胺凝胶 用于单链DNA片段的分离或纯化。 变性的DNA在这些凝胶中的迁移率几乎与其碱基组成及序列完全无关。 用途： 放射性DNA探针的分离、DNA测序反应等。 2 非变性聚丙烯酰胺凝胶 用于双链DNA片段的分离和纯化 注：迁移率受其碱基组成和序列的影响 用途：制备高纯度的DNA片段16