蛋白复习总结.doc
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1、1、蛋白质测序策略: 确定蛋白质的纯度在97%以上; 测定多肽链的数目; 拆分多肽链; 分析每一条多肽链的氨基酸组成; 鉴定多肽链的N-末端和C末端氨基酸残基; 用两种以上方法把多肽链裂解成较小的肽段; 测定各肽段的氨基酸序列; 把各肽段拼接成完整的多肽链; 确定二硫键的位置。2、蛋白质组学的研究特点: 同一性与多样性、有限与无限、 静态与动态、 时间与空间孤立行为与相互作用、单一手段和多种技术、互补与互助3、蛋白质组学研究任务内容:了解某种特定的细胞、组织或器官制造的蛋白质种类、明确各种蛋白质分子是如何让形成类似于电路的网络的、描绘蛋白质的精确三维结构,揭示其结构上的关键部分,如与药物结合并
2、且决定其活性的部位当前任务:发展高通量、高灵敏度、高准确性的研究技术平台研究目的:分离蛋白,显示差异,将表现型与功能联系起来; 寻找蛋白质之间的相互作用,动态地反映生物体所处的状态.4、蛋白质组学研究的两种策略:1) “竭泽法:采用高通量的蛋白质组研究技术分析生物体内尽可能多的乃至全部的蛋白质。2) “功能法”:研究不同时期细胞内蛋白质组成的变化,如蛋白质在不同环境下的差异表达,以发现有差异的蛋白质种类为主要目标5、蛋白质化学和蛋白质组学的不同蛋白质化学 蛋白质组学单一蛋白质 复杂混合物全序列分析 部分序列分析强调结构与功能 强调通过数据库匹配进行蛋白质鉴定结构生物学 系统生物学6、氨基酸的分
3、类及结构特点1) 非极性R基氨基酸 Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Trp、Met共 8 种,这类氨基酸在水中的溶解度较小;2) 极性R基氨基酸 不带电荷的极性 R 基氨基酸 Ser、Thr、Tyr、Asn、Gln、Cys、Gly 带正电荷的 R 基氨基酸 Lys、Arg、His 带负电荷的 R 基氨基酸 Asp、Glu 7、脂肪族氨基酸:甘氨酸 Glycine 、丙氨酸Alanine 、缬氨酸 Valine、亮氨酸 Leucine异亮氨酸 Ileucine亚氨基酸:脯氨酸 Proline 含硫氨基酸 :甲硫氨酸 Methionine、半胱氨酸Cysteine 芳香族氨基酸 :
4、苯丙氨酸Phenylalanine 、酪氨酸 Tyrosine 、色氨酸 Trytophan 碱性氨基酸 :精氨酸 Arginine 、赖氨酸 Lysine 、组氨酸 Histidine 酸性氨基酸 :天冬氨酸 Aspartate 、谷氨酸 Glutamate 含羟基氨基酸 :丝氨酸 Serine 含酰胺氨基酸 :天冬酰胺 Asnaragine 、谷氨酰胺 Glutamine 8、残基:在肽链中氨基酸之间脱去一个水分子,脱水后的残余部分叫残基 (residue),因此蛋白质肽链中的氨基酸统统是残基形式。9、氨基酸的特性:一般一氨基一羧基的氨基酸等电点在pH 6左右,这是由于羧基的解离程度大于氨
5、基,故pI偏酸,碱性氨基酸pI在pH 10左右,酸性氨基酸的pI在pH 3左右。 氨基酸水溶液中其解离度与溶液的pH有关:向氨基酸溶液中加酸时,羧基接受质子,使氨基酸带正电,加碱时,氨基释放质子,与OH-中和,使氨基酸带负电。当溶液的pH=pI时,氨基酸以两性离子存在当溶液的pHpI时,氨基酸溶液中正离子占优势当溶液的pHpI时,氨基酸溶液中负离子占优势。10、氨基酸的化学性质与亚硝酸的反应 Van Slyke定氮与甲醛的反应 氨基滴与酰化试剂的反应 氨基保护基与二甲基氨基萘磺酰氯 (DNS-Cl)的反应 测序与2,4-二硝基氟苯 (FDNB) 的反应 测序 与Edman试剂 (PITC 苯异
6、硫氢酸酯) 测序羧基参加的反应:1. 成盐和成酯反应: 可用于羧基的保护。2。 成酰氯反应:可用于羧基的活化.3。 脱羧基反应:是生成胺类的重要反应。4. 叠氮反应:可用于羧基的活化。11、蛋白质功能的多样性a) 催化:大多数酶是蛋白质。b) 调节:如激素和反式作用因子.c) 转运:如血红蛋白、血清蛋白、载酯蛋白、膜转运蛋白等.d) 贮存:如种子蛋白和卵清蛋白。e) 运动:如肌肉、微管蛋白等。f) 结构成分:如角蛋白、胶原蛋白等。g) 支架作用:如锚定蛋白、连接蛋白等。h) 防御和进攻:如抗体、毒蛋白等.i) 特殊功能:如甜蛋白、胶质蛋白等.12、氨基酸组成的分析a) Edman化学降解法:用
7、此原理已制成蛋白质序列分析仪。若每次循环的准确度为99%, 经60次循环,准确度为:0.9960=0。54b) 降解法:可用氨肽酶和羧肽酶,只能测出末端的几个氨基酸。羧肽酶 Y 可作用于任何氨基酸,有可能以此为基础开发出新的氨基酸的顺序测定仪。c) 根据核苷酸序列推定法:分离mRNA,经反转录测定cDNA的核苷酸序列, 再用遗传密码推定氨基酸序列。d) 质谱法:可分析微量的肽链,短肽在第一台质谱仪中经电喷射电离,按荷质比分离,依次在经碰撞池被裂解成离子碎片,在第二台质谱仪中测出各个离子碎片的谱线,推算出短肽的氨基酸序列。在蛋白质组学中应用广泛,但不能区分亮氨酸和异亮氨酸。13、为何要进行作图分
8、析1) 基因组计划的基本目标是获得全基因组顺序,在此基础之上再对所获得的序列进行解读。获取基因组顺序的主要方法是进行 DNA 测序,然后再将所获取的顺序进行组装以得到完整的基因组序列。2) 基因组测序的第一步是构建基因组图,然后将基因组区段分解后逐个测序,最后进行组装.3) 基因组作图的基本构想:在长链DNA分子的不同位置寻找特征性的分子标记,根据标记将包括这些序列的克隆进行连锁定位,绘制基因组图,该图一旦构建好,即可着手进行全基因组测序。 14、以基因组作图为指导的 2 种测序策略:1) 直接鸟枪法:首先进行全基因组鸟枪法测序,再以基因组图的分子标记为起点将鸟枪法 DNA 片段进行组装。高密
9、度的基因组图分子标记可以检测组装的 DNA 片段是否处在正确的位置,并校正因重复顺序的干扰产生的序列误排.这是一种由下至上(bottom to up) 的测序策略。2) 重叠群 (contig) 法:重叠群是指相互间存在重叠顺序的一组克隆。根据重叠顺序的相对位置将各个克隆首尾连接,覆盖的物理长度可达Mbp。在单个的重叠群中,采用鸟枪法测序,然后在重叠群内组装。这是一种从上至下 (up to down) 的测序策略。15、遗传图的绘制有性杂交实验 根据需要有计划地实施杂交方案而后进行连锁分析,如果蝇、老鼠以及玉米、水稻等动植物的遗传学实验。系谱分析 不能进行有计划的遗传实验,只能收集家系成员的相
10、关资料进行连锁分析,主要涉及人类以及多年生的树木等。DNA转移 不发生减数分裂的生物,如细菌与病毒基因组的连锁分析。16、为什么要绘制物理图?遗传分析绘制的基因组图为何不能指导基因组计划的测序?遗传图的分辨率有限 这一点对微生物不成问题,因为微生物基因组较小,记录成百上千次实验就能获得十分详尽的遗传图,其标记分布密度仅为数千个核苷酸。而人类及大多数高等真核生物由于不可能获得大量的后代,只有少数的减数分裂事件可供研究,连锁分析的分辨力受到很大的限制。因而难以达到基因组测序对基因组图的标记分辨率的要求。遗传图的精确性较低 由于重组热点的存在使得染色体某一区段的交换频率高于其他区段,尤其是倒位区段,
11、由于受到交换限制,无法绘制精确的遗传图。由于存在以上两个局限,因而在进行大规模的DNA测序之前,对大多数的真核生物的遗传图必须进行验证并利用其他的作图技术予以校正和补充。17、常用的物理作图技术:限制性作图 (restriction mapping): 将限制性酶切位点标定在 DNA 分子的相对位置。依靠克隆的基因组作图 (clone-based mapping): 根据欲克隆的 DNA 片段之间的重叠顺序构建重叠群(contig),绘制物理连锁图。荧光标记原位杂交 (fluorescent in situ hybridization, FISH): 将荧光标记的探针与染色体杂交确定分子标记的
12、所在位置。顺序标签位点 (sequence tagged site, STS): 通过PCR或分子杂交将小段 DNA 顺序定位在基因组的DNA 区段中。18、脉冲场凝胶电泳PFGE, pulsed-field gel electrophoresis):是一种分离大分子 DNA 的方法。在普通凝胶电泳中,大的 DNA 分子 (10kb) 移动速度接近,在凝胶中难以形成足以区分的条带。在PFGE中,电场不断在两种方向上(有一定夹角,而不是相反的两个方向)变动。DNA分子带有负电荷,会朝正极移动,相对较小的分子在电场转换后可较快转变移动方向,而较大的分子转向较为困难,因此小分子向前移动的速度比大分子
13、快。PFGE可用来分离从 10kb10Mb 的 DNA 分子。19、常用的指纹分析方法:A 限制性带型 (restriction patterns) 指纹 B 重复顺序 DNA 指纹 (repetitive DNA fingerprints) C STS 目录作图 (STS content mapping) D 重复 DNA PCR (repetitive DNA PCR) 或分散重复顺序 PCR (interspersed repeat element PCR, IRE PCR) 指纹。20、STS作图原理1) 序列标签位点或 STS (sequence -tagged site, STS)
14、是基因组中任何单拷贝长度在100500bp之间的DNA序列,与限制性核酸内切酶的识别序列相关联,每个基因组中仅 1 份拷贝,很易分辨。2) 将染色体DNA随机打断,2个标记所处的物理位置越近,位于同一片段的机率越高3) 随机打断的染色体DNA长度不一,彼此靠近的2个标记有很大的机率位于同一片段,相距较远的标记分开的机率很高.21、作为合格的STS必须要满足2个条件: 它应是一段序列已知的片段,可据此设计PCR反应来检测不同的DNA片段中是否存在这一顺序; STS必须在染色体上有独一无二的位置,如果某个STS在基因组中多个位点出现,则由此得出的作图数据将是含混不清的.22、寻找STS的常用方法:
15、 表达顺序标签 (expression sequence tag, EST) 这是一些从cDNA克隆中找到的小段序列。EST转变成STS的条件是:这个EST来自单拷贝基因而非基因家族成员,后者常常含有相同或相似的序列。 简单序列长度多态性 (simple sequence length polymorphism, SSLP) SSLP产生于重复顺序的可变排列,同一位点重复顺序的重复次数不同,表现出DNA序列的长度变化。与RFLP不同的是,SSLP具有多等位性(multiallelic),每个SSLP都有多个长度不一的变异体。具有多态性并已在连锁分析中定位的SSLP具有特别的价值,因其可直接建立
16、遗传图与物理图之间的联系。 随机基因组顺序 从克隆的DNA中随机测序可获得有用的序列,也可从数据库中寻找感兴趣的某些序列。23、SAGE特点:1) 进行转录物组研究,也就是转录水平的研究;2) 通过快速和详细分析成千上万个EST来寻找出表达丰度不同的SAGE标签序列,从而接近完整地获得基因组的表达信息;3) SAGE区别于差异显示、消减杂交等其它技术的主要特点是可用于寻找那些较低丰度的转录物,最大限度地收集基因组的基因表达信息,这使之成为从总体上全面研究基因表达、构建基因表达图谱的首选策略;4) SAGE可用于在不同环境、不同生理状态及不同生长阶段的细胞和组织表达图谱构建,对不同状态下基因表达
17、水平的定量或定性比较,特别是对疾病组织与正常组织的比较发展迅速。理论依据:1) 来自转录物内特定位置的一小段寡核苷酸序列 (9-11 bp) 含有鉴定一个转录物特异性的足够信息,可作为区别转录物的标签 (tag);2) 通过简单的方法将这些标签串联在一起,形成大量多联体 (concatemer),对每个克隆到载体的多联体进行测序,并应用 SAGE 软件分析,可确定表达的基因种类,并可根据标签出现的频率确定基因的表达风度 (abundance)。步骤:a) 将5g含有oligo dT(引物)的磁珠与RNA混合。b) 合成双链cDNA。c) 用Nla酶消化形成一条链末端有标签的产物。d) 将样品分
18、成两份,连接成含有识别序列的产物,以备用BsmF1消化.e) 用Mme I切割每一个样品形成约60bp的标签。f) 延伸5秒,连接成约130bp的双链标签.g) PCR扩增。h) 用Nla 酶切130bp产物释放34bp双链标签.i) 连接片断形成串联体。j) 克隆到pZErO-1+里,并测序。24、基因芯片的主要应用1) 基因表达检测 拟南芥、酵母基因表达研究等;2) 突变检测 BRCA基因外显子、CFTR基因、地中海贫血、酵母突变菌株、HIV1逆转录酶及蛋白酶基因等的突变检测等;3) 基因组多态性分析 人类基因组单核苷酸多态性的鉴定及分析及人线粒体 16。6kb 基因组多态性的研究等;4)
19、 基因文库作图 通过确定重叠克隆的次序从而对酵母基因组进行作图.25、生物大分子的制备的主要特点: 生物材料的组成极其复杂,常含有数百种乃至上千种化合物。 许多生物大分子在生物材料中的含量极微,分离纯化步骤繁多、流程长。 许多生物大分子一旦离开了生物的体内环境就极易失活,因此在分离过程中如何防止其失活,就是生物大分子制备的最困难之处。 生物大分子中的各种具体物质的组成比例不同. 制备几乎都是在溶液中进行的,温度、pH值、离子强度等各种参数对溶液中各种组成的综合影响,很难准确估计和判断。26、生物大分子的制备步骤: 明确生物大分子制备的目的和要求; 建立相应可靠的分析测定方法; 通过文献调研和预
20、备性实验; 生物大分子制备方案的选择和探索; 生物材料的破碎和预处理; 目的产物的提取及进一步的分离纯化; 生物大分子制备物的均一性(即纯度)鉴定; 目的产物的浓缩、干燥 和 保存。27、生物大分子的分离纯化方法可粗略地分类如下 以分子大小和形态差异为依据的方法:差速离心、区带离心、超滤、透析和凝胶过滤等. 以溶解度差异为依据的方法:盐析、萃取、分配层析、选择性沉淀和结晶等。 以电荷差异为依据的方法:电泳、电渗析、等电点沉淀、吸附层析和离子交换层析等。 以生物学功能专一性为依据的方法:亲和层析等.28、生物大分子样品的早期分离纯化:(1) 特点: 粗提取液中物质成份十分复杂; 欲制备的生物大分
21、子浓度很稀; 物理化学性质相近的物质很多; 希望能除去大部分与目的产物的理化性质差异较大的杂质。(2) 对所选方法的要求: 要快速、粗放; 能较大地缩小体积; 分辨力不必太高; 负荷能力要大。(3) 可选用的方法:吸附;萃取;沉淀法(热变性、盐析、有机溶剂沉淀等);离子交换(批量吸附、胖柱交换);亲和层析;29、生物大分子样品的晚期分离纯化:(1) 可选用的方法:吸附层析、盐析、凝胶过滤、离子交换层析、亲和层析、等电聚焦制备电泳、制备HPLC等。(2) 要注意的一些问题: 盐析后要及时脱盐. 用凝胶过滤时如何缩小上样体积,因为凝胶层析柱的上样体积只能是柱床体积的1/101/6,也可使用串联柱以
22、加大柱床体积。 必要时也可重复使用同一种分离纯化方法,如分级有机溶剂沉淀、分级盐析、连续两次凝胶过滤、离子交换层析等。 分离纯化步骤前后要有科学的安排和衔接,尽可能减少工序,提高效率。如吸附不可放在盐析之后,以免大量盐离子影响吸附效率;离子交换要放在凝胶过滤之前,因为离子交换层析的上样量可以不受限制,只要不超过柱交换容量即可. 分离纯化后期,目的产物的纯度和浓度都大大提高,此时对于很多敏感的酶极易变性失活,因此操作步骤要连续、紧凑,尽可能在低温下(如在冷室中)进行。 得到最终产品后,必要时要立即冰冻干燥,分装并写明标签,20或-70保存。30、蛋白质样品制备原则与纯化方法:原则:(1) 在适宜
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