胚胎实验室操作手册.doc

附件6-01 胚胎实验室操作手册第一节 胚胎实验室每日工作流程第二节 胚胎实验室安全与质量控制一、 实验室安全与感染控制实验室必须有完善的安全制度和防患措施，必须有关于火、电意外引起紧急情况时的应急方案，实验室人员必须了解灾情中的救援措施。为避免停电影响设备正常运转,应备有双重供电系统，或不间断电源(UPS)，以确保二氧化碳培养箱和显微镜等关键设备在意外停电时满足正常工作。1. 所有体液样本（精液、血液、卵泡液等）必须视同潜在污染源,所有的供体组织和体液应有适当的传染病监测。2. 实验室工作人员应清楚乙肝疫苗的必要性并接受乙肝疫苗接种。3. 特别小心不要被那些受体液污染的仪器或设备意外损伤。4. 避免将体液溅到眼中.5. 当接触体液或盛放体液的容器时，应带一次性无粉橡胶或塑料手套。离开实验室时，将手套脱下丢掉，决不可重复使用。6. 离开实验室时,脱掉实验室衣服，不能穿着出入公开场所或餐厅.7. 被体液沾染时，必须马上用消毒液或肥皂清洗.8. 接触配子和胚胎的耗材必须使用一次性用品。9. 因体液溢出污染实验室设备时，应在操作完成后用75%酒精消毒。10. 在实验室体液操作中必须使用机械抽吸装置，禁止用口吸.11. 所有操作步骤和体液处理应小心，尽量减少浮滴和烟雾生成。例如离心时必须用带盖的试管。12. 实验室中严禁吃东西、吸烟等。13. 所有丢弃的体液和用后的一次性物品必须按污染物品处理。二、 实验室质量控制(一) 培养箱的质量控制专人管理,每日确认以下各项内容并予以记录：1. CO2的控制：60.2；2. 温度的控制：370。2;3. 湿度：大于80RH，水盘内水的深度始终保持在大约1cm 以上。培养箱内的水盘使用超纯水,根据不同培养箱要求定期更换,换水当天培养箱不放卵子或胚胎；4. 培养箱显示器温度与培养箱内温度计的温度应一致。不一致时应及时调整校正.5. 消毒清洁:每隔3个月消毒培养箱。消毒时拆卸培养箱内所有钢架，以75酒精和超纯水分别擦拭消毒,再送高压消毒。培养箱内壁以75%酒精和超纯水分别擦拭.消毒清洁完成后，需开机运行稳定后方可使用。(二) 培养用气体的质量控制1. 使用有合法资格的气体供应厂家，气瓶使用前需检查是否有合格证标签.2. 使用医用高纯度CO2（99.995%以上)培养胚胎.每天记录气瓶的压力,定期检查气瓶有无漏气并更换培养箱外气体过滤器。3. CO2进入培养箱之前,必须经过CODA过滤器对CO2进行过滤。CODA过滤器应定期更换,根据供气量，每36个月更换一次。4. CO2分压应与培养箱要求的压力相符，当气瓶CO2气体接近用完时，应及时更换新的气瓶，记录更换气瓶时间.(三) UPS的质量控制重要仪器如培养箱、显微镜、冰箱等必须连接到UPS上，每日观察UPS工作状态，如有异常及时找工程师维修.(四) 液氮罐的质量控制1. 胚胎冷冻液氮罐需每天查看外观，每周至少两次检测剩余量，按时添加液氮，使液氮深度保持在25cm以上。2. 液氮运输罐需专人更换。3. 液氮罐应存放于固定位置。4. 液氮罐应每3年进行一次校验.(五) 超净工作台的质量控制1. 超净工作台层流系统提供洁净环境,用于胚胎培养的准备工作，如培养液配制、培养皿准备、胚胎操作等,不能进行其它存有污染性的操作.2. 超净工作台应于每天工作前提前30分钟开启，台面温度应稳定于设定的温度.3. 超净台每年应至少检测一次洁净度。(六) 实验室层流系统的质量控制1. 体外受精实验室温度维持在242之间，湿度在40%以上，每日观察并记录温度和湿度,如果波动过大及时进行调整，若有异常,尽快维护和处理。2. 在有胚胎的情况下不能关闭实验室净化空调系统。3. 实验室净化空调系统由专业人士检测维护，新风口滤网每24周更换一次，回风口滤网每月更换一次,初效过滤器每13个月更换一次，中效过滤器每36个月更换一次，高效过滤器每12年更换一次,并做好维护检测记录.如遇特殊情况，及时更换。4. 每日观察并记录胚胎实验室与冷冻间、缓冲间、移植手术室及取卵手术室之间的压差。如果压差5Pa，应查找原因，及时检修和维护。5. 每月进行实验室空气细菌培养。(七) 冰箱的质量控制专人管理,每天检测并予以记录。1.冷藏层：28;2.冷冻层:15-20。(八) 热台的质量控制专人管理,每天操作前检测并予以记录.要求:380。5。(九) 实验室仪器设备的使用和维护1. 建立设备常规操作程序,并严格按照操作程序执行。2. 保存各种设备的使用说明文件。3. 仪器设备的维修保养应严格按照规定的程序进行，有关人员在进行保养、调校和维修工作以前，应首先熟悉仪器的性能、结构、使用方法和保养、调校方法，以及维修程序。4. 仪器设备一旦出现异常或发生故障，使用人员应立即关机观察，防止事故扩大,及时向实验室负责人或中心负责人汇报,然后通知修理人员组织维修。5. 定期由专业技术人员对仪器、设备进行校验，建立设备使用档案。(十) 培养基、耗材管理试剂和耗材的订购应选择国内同行公认的有资质的公司和品牌。1. 培养基管理（1） 登记：培养基到货时需立即清点、核对、记录到货时间、试剂名称、编号、批号、数量、收货人等,并注明冷藏品到货时，包装和储存条件是否达到要求。（2） 保存:所有培养液在规定条件下保存至有效期。试剂分装后在各分装容器上做明显标志，标明名称、有效期、分装时间,并用封口膜密封容器口。（3） 使用前准备：培养液使用前必须过夜平衡。平衡方法：使用前一天下午根据需要放入37、6 CO2培养箱平衡备用；含MOPS的培养基放入不通CO2气体的37培养箱内平衡备用。（4） 保质期：矿物油及培养基在有效期内使用。2. 耗材管理（1） 耗材到货时需立即清点、核对，记录到货时间、名称、编号、批号、数量、收货人等。（2） 使用前必须检查有效期和包装是否完好无损，不使用过期用品及包装破损用品.所有耗材送至实验室之前，必须用75%乙醇擦拭外包装，待75%乙醇挥发后放入物品柜.（3） 对产品质量有疑问时,立即停止使用并报告质控科。（4） 每季度清点各种耗材，及时补充并合理安排使用。（5） 不同批号的耗材需要通过精子存活试验后方可使用。(十一) 人精子存活试验使用上游法处理精液，获得活动良好的精子，调整精子浓度为5106/ml，取0。5ml精子混悬液，在待测物品中放置一段时间（35分钟），如吸管、移液管、针管等在精子混悬液中反复抽吸后，再放入5ml试管内，作为实验管。另取0。5ml精子混悬液置于另一试管中，作为对照管.将实验管和对照管置于室温，每24小时用Makler计数板计数实验管及对照管内的活动精子比率,并计算48小时的生存指数。生存指数实验管内精子活动率/对照管内精子活动率.正常生存指数应大于85。如果小于85，应考虑可能有细胞毒素的存在。接触配子与胚胎的一次性耗材应经过人精子存活试验，证明无毒方可使用。(十二) 实验室数据指标的定期回顾总结每月统计实验室的各种数据，进行分析和检查。实验室质量达标标准:1. 受精率:IVF65;ICSI70；2. 卵裂率:90%；3. 优质胚胎形成率：50；4. 冷冻周期率：3050%;5. 卵裂期胚胎冷冻后的复苏存活率：90。如没有达到上述正常标准,须查找原因，及时改正。(十三) 实验室组织管理和质量监督1. 实验室工作人员除进行配子的处理和培养外，还要进行一系列的常规质控监测，意外事件的详细记录和相应对策的结果评估。实验室管理人员必须按实验室的质量保障体系执行，明确实验室的各个环节，严格遵循质量安全程序、标准化的操作方法。2. 应定期对实验室每位成员进行质量监督，避免由于仪器、试剂、个人操作引起的偏差。对于受主观因素影响较大项目，应该进行内部质量控制检查，对实验室工作人员的操作的准确性和精确性进行评价。此外,每个实验室工作人员应接受医学继续教育，学习最新的生殖医学知识。(十四) 中心常用试剂、耗材一览表本生殖医学科目前鼠胚实验常规使用Vitrolife G5系列培养基.试剂名称作用货号Vitrolife G5系列GMOPSTMGMOPSTMPLUS非CO2依赖型培养液在室温、大气环境中处理、操作卵子和胚胎K021893GIVFTMPLUS洗精、受精液上游、受精K022245G1TMPLUS卵裂胚培养液原核期、D2、D3胚胎培养K022244G-2TMPLUS囊胚培养液囊胚培养K021890HYASETM，透明质酸酶消化、移除卵丘细胞K000627ICSITM,PVP精子制动K043116OVOILTM，培养用石蜡油避免液体挥发和污染K991351SpermRinseTM洗精液精子处理:洗精K000621SpermGradTM梯度离心液精子处理：梯度离心K023403其它试剂Quinns精子冷冻液精子冷冻保护剂ART8022SIGMA EBSS缓冲液取卵、移植冲洗液E2888KITAZATO玻璃化冷冻液胚胎冷冻VT101KITAZATO玻璃化解冻液胚胎解冻VT102耗 材耗材名称规格货号Falcon 35mm 培养皿500/case353001Falcon中心井培养皿500/case353037Falcon ICSI皿500/case351006Falcon 5ml试管500/case352003Falcon 14ml试管500/case352001Falcon 15ml离心管500/case352095Falcon 取精杯（样品杯）100/case354013Falcon 1ml移液管1000/case357521Falcon 2ml移液管1000/case357507Falcon 10ml移液管200/case357551Falcon四孔板100/case353654NUNC四孔板120/case176740SIGMA巴氏吸管25/caseS6143德国HIGENBERG吸管26/caseParafilm封口膜1/case13374-16Millipore针头滤器0。22um加藤冷冻叶片10个/包 玻璃化冷冻载杆冷冻用铝支架MTG16965/6000冷冻套管MTG16912/0133PALL气瓶滤器0.20mm 4251HUMAGEN injection针10/盒MIC35-30HUMAGEN holding 针10/盒MPHMED-30COOK ICSI 针10/盒COOK holding 针10/盒BD 1ml注射器100/case300771三、 实验室应急预案(一) 实验室火、电应急预案实验室内应配置灭火器.实验室内的主要设备，如显微镜、培养箱、冰箱等均连接UPS，保证电压稳定,并且在意外断电情况下可提供68小时的电力供应。(二) 设备紧急故障1. CO2培养箱：至少三台备用,每日监测，一旦出现故障，立即报修,并暂时以正常运行的培养箱替代故障培养箱.2. 热台：定期检测,一旦出现故障，立即报修。3. 显微镜：准备灯泡与保险丝的备件,出现故障时及时更换。其它故障立即报修。4. 液氮罐：应始终备有状态良好的备用液氮罐。对现用液氮罐进行定期检测,一旦发现异常泄漏，立即转移故障罐内的胚胎或精子。5. CO2钢瓶:定期检测气压，及时更换。常备至少一瓶CO2。6. 冰箱：每日监测,一旦出现故障,立即报修，并立即转移冰箱内物品。(三) 实验室环境按常规进行监测，温度由层流空调机组调控，发生故障立即报修；若空气细菌培养结果超标，立即清洁实验室，并重新进行空气培养。(四) 一次性耗材按常规进行质控，一旦出现异常，立即更换批号。四、 实验室新人培训计划1. 实验室技术人员必须具备医学或生物学专业本科以上学历，并掌握系统的临床胚胎学知识和细胞培养技能.2. 实验室技术人员应在卫生部批准的人类辅助生殖技术培训基地进修至少3个月。3. 理论学习：卫生部【176】号文件，人类辅助生殖伦理原则，实验室质控,基础内分泌、遗传学理论，人类卵子、精子发生生理，精子获能，IVF、ICSI适应症,卵子形态与成熟度，胚胎序贯培养系统,精子、胚胎冻融原理，ICSI安全性等。4. 实践练习：练习拉管、装针、模拟拾卵、吹打去除颗粒细胞、少弱精子的分离处理。练习ICSI 精子制动、吸打、定点停位，模拟卵子注射。5. 独立工作：在本中心上级技师督导下完成新人培训计划，上级技师考核达标，方可独立工作。第三节 胚胎实验室操作常规一、 精液处理操作常规(一) 精液样本采集1. 射出精液标本的采集（1） 给患者一个明确的书面或口头有关精液采集的指导说明，标本采集时间应为禁欲至少两天，最长不超过七天。（2） 精液需经手淫法收集到一次性无菌无毒的干燥容器内，强调样本收集必须完整，确认是否取精困难，并告诉患者如何运送精液标本。（3） 护士核对患者夫妇姓名、有效证件后，在取精杯杯身及杯盖上标记患者夫妇姓名及病历号.（4） 待患者取好精液后，护士与患者丈夫当面留取精斑样本于基因卡上,并填好相关信息,患者丈夫按指模并在接受助孕夫妇取精认证书签名确认后，护士把标本、基因卡及接受助孕夫妇取精认证书交给实验室人员.（5） 待精斑晾干后编号保存两年，在精液处理记录本上记录患者信息，编号和保存位置.（6） 中心任何工作人员发现患者身份可疑，必须停止接收,重新核实患者身份，不能同时接收2份或以上标本，如怀疑标本混乱，必须停止接收.2. 家中精液样本的采集（1） 对于除了在自家以外的环境下取精的确困难者,必须提出书面申请并签名确认，可以在家中进行样本采集.（2） 给患者以明确的书面或口头形式的有关精液样本采集和转运指导说明，应强调采集样本必须完整,（3） 将已标记患者姓名和病历号的容器交给患者,应在采集后1小时内送到实验室。精液标本不能暴露在过高或过低的温度中,运送途中样本应该保持在2037的环境中。3. 用避孕套采集样本（1） 对于通过手淫法采集精液困难者，则采用特制的避孕套通过性交法获取精液.（2） 告知患者使用避孕套方法以及如何将样本转运至实验室，应记录样本采集的时间，应在采集后1小时内送到实验室。精液标本不能暴露在过高或过低的温度中，运送途中样本应该保持在2037的环境中。（3） 报告中应注明样本的采集是在利用避孕套通过性交法获取的及采集地点（4） 一定不可以使用普通避孕套收集精液，应为它一般含有干扰精子活力的成分（Jones 等,1986)(二) 精液标本分析1. 精液液化（1） 精液取出后室温液化15分钟到30分钟，用吸管或者在显微镜中观察检查精液是否完全液化，在家中或利用避孕套采集的样本通常在送达实验室时已液化。（2） 精液液化延迟的处理，如果60分钟内精液仍未液化，加入等量的含有蛋白的G-IVF再机械吹打以帮助液化,至精液完全液化再进行常规分析和处理.2. 精液外观（1） 正常精液液化后呈均质,灰白，精子密度非常低者可显得透明.（2） 如有红细胞,精液可呈现红褐色，病人如有黄疸或服用某些维生素，精液可呈现黄色。3. 精液体积采用直接测量法测量精液的体积，精确到0.1ml4. 显微镜镜下精液的分析（1） 完全液化的精液，取10ul滴于Makler计数板停留1分钟,显微镜评价精子的相关指标。（2） 观察精液的粘液丝，精子的凝集及非精子细胞（包括上皮细胞,圆形细胞及断裂的精子头或尾部）（3） 评估精子的密度（4） 评估精子的活力和活率（WHO第5版SOP）(三) 精液处理操作常规1. 精液的参数和来源决定应该选择何种精子制备方法精子特征处理方法射出精液浓度5106/ml且PR精子15双层梯度离心+洗涤后上游法1106/ml浓度5106/ml浓度5106/ml且PR精子15%双层梯度离心法附睾取出精，精子数1106/ml且PR精子15%微量梯度离心法射出精液浓度1106/ml附睾取出精1106/ml睾丸精子标本直接离心洗涤法2. 密度梯度法参数可以根据不同标本的特征来修改是方法发到最优化，如：减少梯度体液体体积即减少精子需要移动的距离从而可以提高获得正常精子的数量;对于高粘度的标本,可以增加离心和和离心时间。3. 每一患者准备洗精培养基GIVF Plus两管，每管3ml，提前一天配制好，置37、6 CO2培养箱平衡。准备90密度梯度离心液、45密度梯度离心液各1ml,使用前配好并在1小时内使用.巴斯德吸管在火焰上灭菌，再把吸管尖烧成圆钝，冷却后待用；15ml 锥形离心管（配置梯度离心液）和5ml的圆底试管(上游法）上标上患者夫妇的姓名。4. 根据选择的方法，准备试剂和耗材进行精液样本处理。4.1双层梯度离心法（1） 加1。0ml 45%密度梯度离心液于15ml无菌的圆锥底试管中。（2） 缓慢加1。0ml90密度梯度离心液于45%密度梯度离心液底部,保持两种液体的界面.（3） 将已液化的精液轻轻加于梯度离心液之上，300g离心15分钟。（4） 去上清,剩余精子沉淀约0。5ml，将其加入3ml G-IVF Plus中吹打混匀.（5） 200g离心5分钟.（6） 弃上清，剩余约0.2ml沉淀。（7） 加入适量G-IVF Plus重悬沉淀，计数精子浓度、活力等情况,并记录。置37、6% CO2培养箱待用.4.2 双层梯度离心法+上游法（1） 双层梯度离心法同前面的步骤(1）-（5）.（2） 去上清，留下最下层的精子沉淀约0.5ml，打散混匀。（3） 0。5mlG-IVF Plus加入5ml的圆底试管中，将精子沉淀物打散混匀后缓慢加入圆底试管的底部，松开盖子，45度倾斜放置在试管架上，置37、6% CO2培养箱中孵育上游30分钟.（4） 取上层液体，显微镜下观察并记录处理后的精子浓度、活力，松开盖子，置37、6% CO2培养箱待用。4.3 微量梯度离心法（1） 加0。5ml 45%密度梯度离心液于15ml无菌的圆锥底试管中。缓慢加0。5ml90%密度梯度离心液于45密度梯度离心液底部，保持两种液体的界面。（2） 加入已液化好的精液，如果精液体积较多而精子数较少时再多加一管梯度离心液分离精子。加精液时应慢慢沿着管壁滴入，精液避免与梯度离心液混合,和梯度液之间要有明显分层。（3） 后续步骤同双层梯度离心法的步骤（3)-(5）.（4） 去上层液体，加入适量G-IVF Plus重悬沉淀，显微镜下观察并记录处理后的精子浓度、活力,松开盖子，置37、6% CO2培养箱待用。4.4 直接离心洗涤法（1） 精液标本充分液化。（2） 以1：2（精液：培养液)的体积比例，稀释精液标本。（3） 把稀释的精液标本放入离心管内，每管不超过4ml.（4） 300g,离心10分钟。（5） 弃去上层液体。（6） 把精子混悬液分散在1ml的培养液中。（7） 200g,离心5分钟.（8） 再次弃去上层液体。（9） 轻轻吹打,把精子沉淀重新悬浮在适量培养液中。（10） 显微镜下观察并记录处理后的精子浓度、活力，松开盖子,置37、6% CO2培养箱待用。 （四）精液冷冻操作常规对于部分取精困难，或者因其他原因未能在取卵当日取得精液患者，可采取提前冷冻精液于液氮中的方法将标本保存以作为取卵日备用,以免耽误取卵日授精时机。1. 试剂和耗材准备 QUEENS精液冷冻保护剂复温至室温，精液冷冻支架，巴斯德吸管在火焰上灭菌，再把吸管尖烧成圆钝，冷却后待用；2. 步骤（1） 患者按照精液样本的采集方法留取精液后，置37培养箱中液化。（2） 待精液充分液化后,按照WHO标准进行精液检查，包括精液量、颜色、气味、pH值、液化情况、精子密度、活动率、精子动力以及细胞等情况，并认真做好实验室记录。（3） 将精液加入试管中,按照1：1的比例缓慢加入复温的冷冻保护剂，边加边混匀，充分混匀精液与冷冻保护剂。（4） 将混匀后的液体分装至冷冻管内,在冷冻管上做好标记并将冷冻管装上已编号的冷冻支架。（5） 将冷冻支架放置在距离液氮面15cm的液氮蒸气中，保持1020分钟。（6） 将冷冻支架投入液氮,冻存。（7） 将精液冷冻患者的信息，精液分析结果，及冷冻位置及编号详细记录于精液冷冻登记本。（五） 精液复苏操作常规1. 试剂和耗材准备精液处理的常规试剂盒耗材，37摄氏度水浴锅,温度计等2. 步骤（1） 查找需要复苏的精液标本，从液氮罐中取出标本，核对冻存管上的信息。（2） 将精液标本放置于提前加热的37摄氏度水浴锅中15分钟左右.（3） 将标本管打开，取10ml样本涂片，生物显微镜观察并记录。（4） 根据复苏后精子的活动力和精子密度，选择相应的处理方法。（5） 复苏后的精液信息需在精液冷冻登记本中进行标记，包括复苏时间，精子的活力，密度及用途。（六）逆行射精病人的尿液处理操作常规1. 一些患者在射精过程中精子会逆行到膀胱里，从而导致了无精子症或者没有明显射精现象。射精后尿液检查中发现精子就可以确诊逆行射精。当药物治疗不能达到目的时，有必要从尿液中提取精子。2. 患者在取精24小时之前服用小苏打片.常用剂量是每天4次，每次4片（1g/片）。其作用使尿液呈碱性，精子更易存活。3. 在取卵的当天早上，患者应该在起床排空尿后，在取精的前2-3小时，再服用小苏打片2片（1g/片)喝500-1000ml水，如此能够最大限度降低尿液的渗透压。4. 标本采集和接收按照精液标本采集与接收操作规程执行。5. 用手淫的方法往精液杯子内射精。6. 射精后,患者及时排尿于无菌的取精杯中，并将射出的精液和尿液同时送精液处理室。精液和尿液样本都需要进行分析。由于尿量很多，所以需要500g离心10分钟.7. 离心后的逆行射精样本若有精子,按照射出精液处理操作规程进行。(四) PESA精子处理操作常规1. 每一患者准备洗精培养基 GIVF Plus两管，每管3ml，提前一天配制好，置37、6 CO2培养箱平衡。准备90%密度梯度离心液、45密度梯度离心液各1ml，使用前配好并在1小时内使用.2. 术前，实验室为男医科生准备1管预平衡的G-IVF Plus和2-4支5ml圆底试管。3. 把巴斯德吸管在酒精灯上灭菌，再把吸管尖烧成圆钝,冷却后待用，并连同15ml锥形离心管、5ml圆底试管一起标上患者的姓名。4. 实验室人员和临床医生同时核对患者姓名及其妻子姓名，在附睾、睾丸取精/活检手术记录上签名。5. 附睾穿刺手术中，实验室人员用移液器吸取少量送检的附睾抽吸液涂于无菌Falcon3001培养皿，在显微镜下观察是否有精子；如发现有活精子，精子数目足够ICSI,通知男科医生结束手术;如未见足量精子,重复上述操作。6. 反复穿刺未果，由临床医生决定是否改行TESA.7. 精子数目1106，PR精子15的附睾穿刺液，可以用微量梯度离心法进行处理.8. 精子数目少的附睾穿刺液可以用直接离心洗涤法进行处理，处理好的精子在镜下观察并记录,松开盖子,置37、6% CO2培养箱待用。9. 完成相应的实验室记录和病历。(五) TESA精子处理操作常规1. 术前一天准备4管G-IVF Plus，每管3ml，置37、6 CO2培养箱平衡.2. 术前，为临床医生准备2个加3ml G-IVF Plus 的Falcon3001皿，2个1ml的注射器。3. 实验室人员和临床医生同时核对患者姓名及其妻子姓名，在附睾、睾丸取精/活检手术记录上签名。4. 用无菌巴斯德吸管在火焰上灭菌,再把吸管尖烧成圆炖，冷却后待用，并连同15ml、5ml的圆底试管标上患者的姓名.5. 睾丸穿刺前准备一个小皿，加入2ml GIVF Plus给医生。准备两个1ml的注射器和两个小皿，加入2ml的GIVF Plus。6. 临床医生从睾丸中抽吸出曲细精管放于盛有G-IVF Plus的Falcon3001皿中，送实验室。用平衡好的GIVF Plus至少洗涤一次后，将曲细精管移在另一有GIVF Plus的Falcon3001皿中，在体视镜下，用两个注射器针头，划开曲细精管，在倒置显微镜下观察是否有精子。若精子数量能够满足临床应用，通知男科医生结束手术。7. 将有精子标本的Falcon3001皿置室温培养箱孵育2h。8. 将睾丸组织混悬液转移至离心管中，静置2分钟,用巴斯德吸管将大块组织移走,300g离心5分钟,去上清，留取0。10。2ml沉渣，混匀松盖后置37、6%CO2培养箱，备用。9. 完成相应实验室记录和病历.二、 捡卵操作常规(一) 捡卵前配液准备1. 配液在取卵前一天进行。2. 卵泡冲洗培养液（GMOPSTM)：取G-MOPSTM10ml放入圆底试管（Falcon 2001）中，加入肝素300IU/100ml，紧盖后置37培养箱中平衡过夜，备用。3. 捡卵皿的准备：吸取GMOPS Plus3ml培养液加入培养皿（Falcon 3001）内盖矿物油2ml，每个患者准备2个，放在不通CO2气体、37培养箱内过夜平衡。4. 洗卵液的准备:吸取3mlGIVF Plus培养基放入圆底试管（Falcon 2001）中，每个患者准备2管,置37、6 CO2培养箱平衡。5. 受精皿的准备：准备四孔板，每孔加入受精培养液（GIVF Plus)800ml，盖矿物油0.5ml,准备的四孔板个数依据各个患者的卵泡数估算,8个准备一块四孔板,8-16个准备2块四孔板，依此类推，放置37、6% CO2培养箱平衡.6. 如为ICSI授精方式，准备卵裂液培养皿:用G1 Plus做成10个微滴，每滴25ml，盖矿物油3.0ml，每个患者准备数目参照四孔板数，置于37、6 CO2培养箱内平衡.(二) 捡卵1. 根据患者卵泡数目,在IVF工作站台面上预热一定数量Falcon 3003培养皿。2. 检查实验室记录单上患者的姓名，并与患者和临床医生当面核对，确保无误。3. 检查已平衡好的培养液，包括冲管液，洗卵培养液和受精培养液。4. 收集在试管内的卵泡液倒入Falcon 3003培养皿内,形成一薄层液体，轻轻振荡，迅速扫描卵冠丘复合物（OCCC）的存在,用巴斯德吸管吸起后在解剖显微镜下确认。典型的OCCC用肉眼可看到，为灰色透亮的粘液团,中央见到的小的白点为卵母细胞和放射冠，通常直径在2-4mm大小。在体视镜下（20-50倍）观察，确诊粘液团内是否有卵母细胞存在，如有OCCC附于血凝块上，可直接用巴斯德吸管分离。将选出的卵子先置于捡卵皿中暂存。5. 取出平衡好的洗卵液加入已预温的小培养皿中（Falcon 3001）；更换巴氏吸管，将捡卵皿中的卵子转入洗卵皿中洗涤2次，再转移至受精皿中，每孔不超过3枚卵子，立即将受精皿置于培养箱内培养。在记录表上记录取卵情况及卵子所放置培养箱编号,并在培养箱贴上标签。6. 为保持卵母细胞的活性，应尽可能缩短卵子暴露在培养箱外的时间,要求整个操作过程必须无菌、快速，并注意避光，温度维持于37,以尽量减少培养液的pH值和渗透压变化。7. 取卵过程如发现异常，如未见卵母细胞，获取数明显少于卵泡数,及时与医生沟通.8. 捡卵结束后,粗略评估卵母细胞的质量和成熟度，确定合适的授精时间,通常需培养36小时。三、 体外授精操作常规（一） 体外授精1. 授精前提前30分钟打开恒温操作台进行预热,将圆底加热试管架放置于台面同时加热，使温度稳定在37左右。2. hCG后3940小时，取卵后46小时进行IVF授精。3. 从培养箱中拿出处理后孵育的精子悬液的小圆底试管,轻轻摇晃混匀，放置于圆底加热试管架上，用移液器取10ml滴于Marker计数板,生物显微镜下观察精子的浓度、活动力。4. 根据受精前的精子活力和精子形态决定是否增加或减少所加精子的量.通常用于授精的精子终浓度为1105/ml。5. 从培养箱拿出受精皿，双人核对皿上标记的姓名和小圆底试管上所标记的名字是否一致，在显微镜下观察卵子的情况和核对卵子的数目。6. 用移液器吸出适量精子，在远离卵子处将精子悬液加入受精皿。7. 将受精皿置37、6% CO2培养箱中继续培养。8. 及时完善实验室记录。（二） IVF受精卵脱颗粒细胞1. 卵子脱颗粒细胞的前一日，根据取卵数目准备卵裂液培养皿。卵裂液培养皿：用G1 Plus在Falcon 300l小皿中做10个液滴，中间两滴用于清洗,每滴25ml,盖上矿物油3。0ml，置于37、6 CO2培养箱内平衡过夜。2. 提前30分钟打开恒温操作台预热,将圆底加热试管架放置于台面同时加热，使温度稳定在37左右.3. 脱颗粒针的拉制：取两根巴期德吸管煅烧拉细成微吸管,一根稍粗，口径约为200mm；另一根稍细，口径约为140mm。要求端口平齐并钝化。4. 用稍粗的巴斯德吸管将卵子转移到剥卵皿液滴,再用稍细的巴斯德吸管吹吸受精卵数次，尽量除去颗粒细胞直至可清晰观察受精卵。5. 把卵子转移到剥卵皿液滴，先用微吸管吹吸受精卵23次，尽量除去颗粒细胞直至可清晰观察受精卵。6. 从培养箱内取出准备好的卵裂培养液微滴的皿，标记患者姓名和皿号，和另一个工作人员核对无误.用另一根微吸管将所有已脱颗粒的受精卵转移到卵裂皿中央液滴洗涤23次后转移至周围的液滴中。7. 受精观察：将装有受精卵的培养皿放在倒置显微镜下，观察原核。四、 卵胞浆内单精子注射（ICSI)1. ICSI实验室指征1.1 严重的少、弱、畸形精子症（1） 重度少精子症:1106/ml射出的精液中精子密度5106/ml；（2） 重度弱精子症:1%前向运动精子（PR）10%；（3） 重度畸形精子症：1正常形态精子2%；（4） 极度少精子症：精子密度1106/ml；（5） 极度弱精子症：前向运动精子（PR）1%；（6） 极度畸形精子症：正常形态精子1。1.2 PESA/TESA获得的精子;1.3 常规IVF受精失败(成熟卵子受精率低于30%)。2. 培养液准备：按每个剥卵用培养皿处理8个左右卵子，每个培养皿需要4mlG-MOPS Plus。取卵前一天下午根据卵泡数量准备剥卵用培养液GMOPS Plus，加入Falcon 2001圆底试管中,盖紧盖子,放在37培养箱内平衡。另准备2个卵裂液培养皿：用G1 Plus做成10个微滴,每滴25ml,中间两个滴用于清洗，盖矿物油，置37、6 CO2培养箱内平衡。3. 提前30分钟打开恒温操作台，将圆底加热试管架放置于台面同时加热，使温度稳定在37左右.4. 取卵后2-4小时对卵子进行脱颗粒细胞操作。准备一个四孔皿，在第一孔中加入配制好的透明质酸酶0.5ml，其余三孔加入平衡好的G-MOPS Plus各1ml，在37培养箱孵育15分钟。5. 脱颗粒针的拉制：取1根巴斯德吸管，保持原口径，煅烧钝化端口。再取3根巴期德吸管煅烧拉细成微吸管，2根稍粗，口径约为200mm；第3根稍细，口径约为140mm.要求端口平齐并钝化。6. 用原口径巴斯德吸管将不多于8个OCCC移入含透明质酸酶的孔中冲洗吸打3060秒，至外层颗粒细胞脱去后,用稍粗口径吸管将卵子移入G-MOPS Plus中.7. 换稍细口径吸管继续吹打,以去除剩余的颗粒细胞层，再改换新的稍粗口径吸管将卵子移入GMOPS Plus中洗涤，再转移至已预平衡过的G1 Plus微滴皿中，置37、6 CO2培养箱中备用.8. 准备ICSI操作皿（Falcon 1006）：在皿底和皿盖标记好患者姓名.中间做三个圆形的PVP滴,每滴7ml；左方用7ml PVP划写一个椭圆；右方用平衡后的G-MOPSTM Plus做数个7ml的液滴;如下图所示。在双人核对下，在椭圆的PVP边缘加入微量处理过的精子，覆盖已平衡过的矿物油，置37培养箱内备用。9. 安装、调节显微注射系统：打开显微镜、显微操作系统及载物台热台，确保所有操作控制都恢复至原有的可控操作内,可以平稳、舒适地进行操作。安装持卵针和注射针时，应避免注射针管道系统中有气泡。在4物镜下调整持卵针和注射针,依次调节其角度与位置，使两者针头相对并与载物台平行，前后左右移动操作针，10、20物镜下检查所操作针的移动范围.10. 将持卵针和注射针升高，确保操作台与热台之间的高度能够轻松放置操作皿而不碰及操作针。11. 在双人核对下，将已选好的M卵转入ICSI操作皿的GMOPSTM Plus微滴内，每滴1个。将盛有卵子的操作皿放置于调好的显微镜操作仪的热台上；10物镜下调节显微镜焦距使操作皿内微滴的边缘清晰可见。将注射针降入ICSI操作皿的PVP液滴中，调节显微镜使注射针清晰可见,同时吸入少量PVP进入注射针。12. 精子制动：将注射针移入含有精子的条形PVP液滴中，在微滴上端选择形态、活力正常的精子吸入注射针,转入另一PVP微滴,将精子放置于操作皿底部。将注射针在精子尾部中段或下段轻压，迅速回拉注射针，划过精子，使其制动.将精子先尾后头吸入注射针内，然后将注射针转入卵子的G-MOPSTM Plus微滴中。13. 卵胞浆内单精子注射：降下持卵针，并轻拨动卵子，使第一极体位于12点或6点位置,固定卵子。调节显微操作针和卵膜至同一水平面，将精子推至注射针尖处，于3点钟处垂直穿过透明带并继续进针，至卵中心或越过中心位置（卵母细胞直径的5075）,轻微回吸注射针，当胞浆和精子出现快速返流的过程，指示卵膜已破，停止回吸,将精子缓慢注入卵子胞质内，缓慢退出注射针。退出注射针后,调节持卵针负压，释放卵子.14. 重复上述步骤至所有的成熟卵子都注射完毕,将ICSI皿从显微镜热板转移至解剖镜下，从培养箱取出卵裂培养皿，每个卵子在培养皿中央两个液滴中漂洗数次,再转移至旁边微滴中放回培养箱。15. 注意事项（1） 将精子和卵子加入操作皿中都必须双人核对皿上的患者姓名、精子、卵子的标记，并签名确认。（2） ICSI操作皿制备要快速，同一时间只能准备1个皿，要避免微滴蒸发脱水,临近ICSI操作时准备。（3） 尽量减少PVP注射入卵子中.（4） 用注射针制动精子要避开其颈部.（5） 精子注射进入胞浆的深度约为卵子直径的5075.（6） ICSI操作时动作要轻柔快速,从制动精子至