组织工程重点.doc

组织工程的三要素及其功能
1. 支架:诱导立体定向生长、诱导血管生长、供给营养物质及生长因子，处理代谢废物，模拟细胞外基质的微环境。
2. 种子细胞：可来源于自体细胞、同种异体细胞、异体细胞、干细胞;可通过单层贴壁生长、悬浮生长、三维立体生长等方式来培养。
3. 生长因子：可刺激种子细胞的生长和分化，调节种子细胞的活性。
组织工程的操作过程
选择合适的支架材料→对支架进行塑形→在支架上种植活细胞→添加合适的生长因子→种子细胞沿支架材料多向生长,形成三维立体组织（在生物反应器中)→移植到人体内→重建该组织功能→新生组织中血管生成→支架材料溶解→新生组织最终与人体内环境融合
支架材料的选择标准
1． 具有生物相溶性及功能
2． 表面理化性质易于细胞的粘附和增殖
3． 可控的生物降解和生物吸收性质
4． 有很好的机械强度，可承受压力，例如骨组织支架材料
5． 三维支架材料具有多孔性，使各个微小的结构可以相互连通
6． 没有免疫原性
7． 不会引起感染
8． 性质稳定
干细胞
是一类幼稚型细胞，具有增殖和分化的潜能以及自我更新的能力，可以分化形成各种成熟的体细胞类型.根据其分化潜能大小可分为全能干细胞、万能干细胞、多能干细胞、专能干细胞.
干细胞的分类
Totipotent：受精卵，可分化形成所有体细胞类型
Pluripotent：胚胎干细胞，分化形成三个胚层来源的细胞
Mutipotent：骨髓间充质干细胞等，分化形成单一胚层来源的细胞
Unipotent：各组织内干细胞，只能分化形成该组织细胞
干细胞来源
胚胎来源：胚胎干细胞：ES细胞
胚胎性腺轴细胞：EG细胞 （生殖嵴干）
畸胎瘤细胞：EC细胞
胎儿来源:脐带、胎盘、羊水
成体来源:骨髓：造血干细胞、间充质干细胞
组织:神经、骨骼肌等组织内专能干细胞
ES细胞
来源于5—7天未植入囊胚内细胞团，具有自我更新的能力（每一次分裂形成两个细胞,其中一个继续分化，另一个保留下来，仍是ES细胞），是万能干细胞，可分化形成三个胚层来源的细胞。
成体干细胞
是一类存在于分化成熟组织中的未分化的细胞，具有自我更新的能力，可分化形成该组织各类型细胞.
胚胎干细胞和成体干细胞的对比

ES胚胎干细胞
成体肝细胞
细胞类型
Pluripotent万能
Multipotent多能
增殖能力
增殖旺盛
增殖限制
来源
不是自体的
自体的
伦理问题
伦理方面的担忧
很少争议
致癌性
致癌的
不致癌的
成体干细胞类型（主要)
骨髓间充质干细胞（MSC)
造血干细胞(HSC）
神经干细胞（NSC）
肝干细胞
MSC提取
取骨髓→离心→取低密度层细胞→培养
成体干细胞可塑性
成体干细胞是一种多能干细胞，正常情况下只能分化形成改胚层来源的细胞，但成体干细胞仍具有可以分化形成其他胚层分化来源细胞的能力，即跨胚层分化。
造血干细胞定位转移
成人：HSC存在于脊髓和淋巴组织中
胎儿：HSC存在于卵黄囊、肝、脾中（髓外造血)
造血干细胞HSC
多能干细胞，①可通过增殖和分化形成红细胞、白细胞以及其他血细胞，补充衰老和死亡的血细胞，重建整个造血系统。②常常被用于白血病以及其他血液病的治疗。③含量极低,仅占骨髓细胞的1/50000。④具有自我更新的能力，产生新的HSC细胞以及分化形成各血细胞类型。
造血干细胞特性及来源
特性：具有很强的自我更新以及增殖和分化的能力
CD34是HSC的表面标记
多能干细胞，可分化形成髓系各祖细胞类型，产生所有的血液细胞
产生特异性的生长因子受体
来源：骨髓、外周血、脐带血、胚胎干细胞
造血干细胞和祖细胞的区别
1. 造血干细胞在一定因素的调节之下可以分化为各类血细胞的祖细胞
2. 祖细胞也是一种相当原始的具有增殖能力的细胞，但已失去多向分化的能力，只向一个成几个血细胞方向定向增殖分化。
3. 造血干细胞分化形成不同的祖细胞，祖细胞进而分化形成各幼稚型的血液细胞。
4. 祖细胞依靠HSC的增殖分化来补充。
生物材料发展过程
组织工程促进生物材料的发展:
A． 上个世纪，生物材料被用于生成永久性植入物来替代组织器官，例如假肢。
B． 本世纪，生物材料主要被用于生产支架,用于组织工程。
C． 未来生物才来的发展方向是用于生产组织工程支架,并且可为种子细胞生长提供所需微环境，以及用于基因治疗。
支架的作用
1. 支架为种子细胞的粘附、迁移、增殖分化以及分泌细胞外基质提供框架。
2. 种子细胞在支架材料上生长形成完整的组织后，支架材料通过生物降解而被吸收.
3. 支架还可作为一种屏障保护新生组织，防止周围组织向新生组织渗透,从而有利于新生组织的再生.
天然材料
天然:胶原、纤维、透明质酸、琼脂等
合成：PLA、PGA
混合材料:天然与合成材料的相混合
陶瓷：羟基磷灰石等
天然与合成材料的对比

优点
缺点
天然
A． 存在细胞识别，种子细胞与支架材料通过配体和受体间相互识别以利于种子细胞的粘附
B． 可自然讲解
A． 可引起免疫排斥反应
B． 批次间存在差异，因为材料来源于天然而非人工生产
合成
A． 批次之间差异小，具有统一性
B． 可根据需要进行人工塑形
A． 生物相溶性尚未被认可
B． 可降解性尚未被认可
生物材料形成
膜状或管状：神经组织、血管
凝胶状:种子细胞可均匀散布其中，软骨组织
多孔状:三维立体支架、骨、软骨、真皮
支架的作用
A． 干细胞种植在支架上，支架移植入体内正确的位置
B． 支架上携带的各种细胞因子刺激种子细胞分裂增殖
C． 支架为种子细胞的增殖分化提供营养及框架
D． 当种子细胞不断分裂增殖形成的结构足以自我支撑时，支架开始生物降解
外周神经与中枢神经再生修复不同的原因
外周神经受损后可再生，中枢神经再生受抑制.中枢神经系统微环境中存在抑制轴突生长的因子。例如中枢神经系统中的胶质细胞可产生各种抑制因子，而髓鞘细胞仅在中枢中存在,也可产生各种抑制因子。所以中枢神经系统的再生受到微环境抑制。
Ips细胞：借助基因导入技术将某些特定因子导入动物或人的体细胞,同时选择性地在培养液中加入特定的小分子物质，即可将体细胞重编程为多潜能干细胞此类细胞在克隆形态、生长特性、表面标志物、基因表达模式、表观遗传学特征、拟胚体形成、畸胎瘤形成和嵌合体形成（针对小鼠)等方面与ES细胞非常相似.
诱导性多能干细胞(ips）是通过基因转染技术将某些转录因子导入动物或人体细胞，使体细胞直接重构成为胚胎干细胞细胞样的多潜能细胞.
肿瘤干细胞（cancer stem cells，CSCs 或 Tumor stem cells ，TSCs）:肿瘤组织中这些致瘤能力强、有自我更新和分化潜能的细胞。
肿瘤干细胞来源的假说主要有两种:
第一种认为正常干细胞是肿瘤发生的源泉，致癌性突变使正常干细胞内在的自我更新和无限增殖能力得到加强,从而转变为肿瘤干细胞。
第二种认为分化较为成熟的细胞（如定向分化的祖细胞)收到外界突变剂、诱导剂等的作用而活化了某些干细胞相关途径，去分化而获得干细胞特性，形成肿瘤干细胞。
基因工程
将植物或动物的基因用载体导入活细胞内,与生物体基因相整合，从而改变生物原有的特性，通过基因工程的方法可以使外源基因替代体内有缺陷的基因从而恢复该基因的功能。
肌腱组织工程
肌腱和韧带有束状致密结缔组织组成，能接到正常的关节运动及维持关节的稳定。
种子细胞
成熟机体细胞：肌腱细胞：自体，取材创伤大,数量难以满足要求
皮肤成纤维细胞：自体,取材广泛，数量多,易培养
脊髓间充质干细胞:自体,免疫原性低，增殖能力强，分化的多能性-——-不确定
肌腱细胞合成胶原的能力优于间充质细胞和成纤维细胞，是较好的肌腱组织工程的种子细胞来源
细胞因子
EGF—1：促进肌腱细胞的分裂增殖和细胞外基质的产生
TGF—β1、BMP—12：加速肌腱的愈合
BMP—2、BMP—12:促进肌腱附着于骨的连接处纤维软骨区的新城
BMP-2、BMP—12：诱导MSCs生成韧带样组织
EGF：促进细胞增殖
支架材料
必须具有一定的机械强度、孔隙度及吸水率，可降解,适合种子细胞吸附及增加细胞增殖，并对种子细胞的目的的功能不产生负面的影响，具有良好的生物相溶性等特性。
天然材料：I型胶原、糖胺多糖、羊膜、冻干肌腱等 ,缺点：抗原性强
人工合成材料:碳纤维、尼农、涤纶、聚羟基乙酸(PGA），聚乳酸(PLA）、聚乳酸聚羟基乙酸共聚物（PLGA）。缺点：滑动性差，易与周围组织粘连亲水性差，细胞粘着力弱.
复合材料：PLGA与胶原的复合，人发与胶原的复合
人发角蛋白:HHK
组织工程化肌腱的构建
目的：获得人工活性肌腱—-—种子细胞及细胞外基质的装配
构建要求:
体外：支架材料必需有足够的空隙来附着种子细胞
体内：必须尽可能少地对细胞及周围组织产生毒性反应。
基质支架必须允许细胞滞留并可以传递有活性的细胞到达修复部位。
旋转式细胞培养系统（RCCS）优点：
在微重力条件下：低剪切力
大小不同的颗粒共同培养
有助于三维组织的形成
有助于细胞的分化
骨组织工程
骨组织细胞:骨祖细胞、成骨细胞、骨细胞、破骨细胞
软骨的发生：间充质细胞→骨祖细胞→成软骨细胞→软骨细胞→基质+纤维→软骨组织周围间充质→软骨膜
种子细胞
成骨细胞是骨组织工程的种子细胞。目前种子细胞的来源主要有骨外膜、骨髓、骨、骨外组织。

优点
缺点
骨外膜
含有骨原细胞、成纤维细胞、成骨细胞和破骨细胞。骨原细胞保持着分化潜能,可被激活增殖分化为成骨细胞。取骨外膜培养可分离出成骨细胞。
具有很强的繁殖和分化为成骨细胞的能力,易存活
供区组织的损伤
骨髓
成骨能力来自骨髓基质细胞中的纤维细胞集落形成单位,它具有多向分化的潜能，可分化为成骨系细胞、成纤维系细胞、脂肪细胞和网状细胞。在诱导因子作用下，可使其向成骨细胞系分化的数量大大增加，表明骨髓基质具有很强的成骨潜能。
取材容易，损伤较小，传代能力强
因基质细胞具有多种分化潜能，应选择适当培养条件,保证其向成骨细胞分化。
骨
胚胎与新生动物骨及人胚胎骨经培养得到成纤维细胞样细胞，适当条件可进一步分化为成骨细胞
易定向分化为成骨细胞
供区损伤及来源的局限性
骨外组织
起源于胚胎时期间充质的骨外部位的骨祖细胞，在诱导因子的持续作用下可维持其成骨的功能。如周皮细胞、C212成肌细胞、成纤维细胞等。家兔皮肤的成纤维细胞在体外培养，不仅能产生粘多糖和胶原等基质成分，还有钙盐沉积，有新生骨组织形成,证明皮肤成纤维细胞在体外有成骨的潜能
取材容易、创伤小，传代繁殖快
适应受区环境的能力较差
支架材料
1. 良好的生物相溶性、生物可降解性
2. 良好的骨诱导性和骨传导性
3. 具有负荷最大量细胞的高渗透性
4. 支持骨细胞生长和功能分化的表面化学性质与微结构
5. 可与其它活性分子如骨形态发生蛋白（BMP）、转移生长因子-β（TGF—β）负荷共同诱导骨发生
6. 易消毒性
人工合成聚合物
--—聚乳酸（PLA）和聚羟基乙酸（PGA）
-—-聚乳酸与聚羟基乙酸共聚物（PLGA）
—--多聚羟基酸、聚酣、聚亚胺、聚偶磷氮、胶原
——-具生物活性的玻璃陶瓷（BGC)、羟基磷灰石（HA）、钙磷陶瓷即羟基磷灰石和磷酸三钙（HA/TCP）
珊瑚
天然无机骨：除去其有机成分,保留无机成分
生物性和非生物性材料符合:适合的支架材料与BMP、GF的复合
生长因子
成纤维细胞生长因子（FGF）
转化生长因子-β(TGF—β）
胰岛素样生长因子(IGF）
血小板衍化生长因子（PDGF）
骨形态发生蛋白（BMP)
构建方式:支架材料+成骨细胞
支架材料+生长因子
支架材料+成骨细胞+生长因子
神经组织工程
神经组织由神经细胞和神经胶质细胞构成.构成脑、脊髓和神经节。
神经细胞本体受伤或近本体的突起受伤,神经元会死亡。
远离神经元的突起受伤，包体肿胀，尼氏体破碎,伤口处髓鞘和轴索破碎，由巨噬细胞吞噬，只有神经膜细胞繁殖，形成实心的细胞索，在断裂处连接起来，引导新生轴索往远端生长。
若远端彻底消失，神经元就不能恢复原来功能。
若受伤的混合神经纤维，再生的神经纤维长到另一个神经纤维的神经膜中，仍不能回复功能。
种子细胞
雪旺细胞(Schwann cell）经培养和纯化后的雪旺细胞在支架内有序分布,并且分泌多种神经营养因子,支持引导轴突的再生，是提供啊修复神经缺损效果的关键。
构筑组织工程化人工神经，首先需要大量雪旺细胞。
但在培养条件下，雪旺细胞生长缓慢，而且容易为成纤维细胞污染.
应用神经体内变形发，可获得大量纯度较高的激活态雪旺细胞。
支架材料
聚羟基乙酸（PGA）
乙丙交酯（Polyglactin）
聚乳酸(PLA）
壳聚糖(Chitosan）
优点：具有良好的生物相溶性，不引起明显的炎症反应，再生有髓神经纤维能沿生物纤维纵向生长。
在神经导管内植入生物纤维网架或将神经导管制成具有类似神经束状结构,可引导、促进神经轴突的再生。
生长因子：
用生物降解高分子对神经营养因子进行基体包埋或制成微包囊,然后与科生物降解的神经导管进行复合，从而可使神经营养因子控制性地释放到神经导管内，醋精神经轴突生长.
脑源性神经营养因子（BDNF）和睫状神经营养因子（CNTF）
神经生长因子（NGF）
人工神经的构建—-—血管化
神经导管内的血管的长入,可为种植的雪旺细胞和再生神经提供充足的营养，从而加快神经再生，延长神经的再生距离。
管内植入血管或加入血管内皮细胞生长因子,可望促进神经导管的血管化.
人工神经的构建--—生物反应器的应用
利用转壁式生物反应器所产生的模拟微重力，使细胞在旋转过程中均匀地分布于在经过Laminin涂层的PGA材料的表面。
实验表明,应用低密度（103/ml)的雪旺细胞，即能使旺细胞均匀贴附在生物支架表面.
脊髓损伤
不但取决于即刻的机械损伤,还取决于损伤后形成的细胞微环境。
继发的缺血、缺氧、炎症细胞浸润，自由基生成,内在的可以克服抑制因子的成熟神经元大量丢失，体内的髓鞘相关抑制因子可抑制与功能恢复密切相关的轴突的再生，胶质细胞增生形成的瘢痕均在脊髓的继发损伤中起着重要的作用.
种子细胞
Neural Stem Cells , NSCs
Olfactory ensheathing cells , OECs
Schwan cell , SC
生物材料：大体分为五类
1. 天然聚合物：藻酸盐水凝胶、I型胶原
2. 合成生物可降解材料如：聚乳酸、聚乙烯乙二醇
3. 合成生物非降解聚合物如：聚甲基丙稀酸羟乙酯
4. 可降解材料复合物如：聚β—聚羟基丁酸盐（PBH）与藻酸盐水凝胶复合物
5. 非降解材料复合物导管如：丙烯酸聚合物或聚丙烯腈/聚氯乙烯（PNA/PVC)的共聚物
携带因子或者转基因细胞：释放神经生长因子，神经再生抑制因子拮抗剂等
两种类型的材料设计：定向孔-——引导神经纤维再生，可注射性,防粘连
生长因子
神经营养因子：NT、BDNF、EGF
生长因子被整合到支架材料商后，通过材料讲解或者浓度差异以一定的速率释放出来,其结果可以改善受损神经周围微环境和促进细胞的生长,还可以促进神经干细胞定向分化成为神经细胞。
脑组织工程
修复材料:明胶和透明质酸微球 (透明质酸基水凝胶框架材料）
待解决的问题
细胞再材料中的高密度复合
材料可注射性，减少手术导致的二次损伤
角膜组织工程
组织结构
上皮层：5-6层上皮细胞,可再生
前弹力层：均质透明膜，不可再生
实质层：由约200层胶原纤维薄板组成,不可再生
后弹力层:贱人的透明均质膜,可再生
内皮细胞层:为一层六角形扁平细胞构成，不可再生
生理特性
屈光度：占眼球屈光力的70%
透明性：无角化层,无血管，无色素，始终保持半脱水状态
无血管：营养来自角膜缘血管网，房水及泪腺
感觉神经丰富：来自三叉神经眼之.保护作用
种子细胞
可来源于眼的正常角膜,以胎儿眼角膜为佳，供体年龄越小，细胞分裂增殖越快
角膜上皮细胞培养常用植块培养法和分离细胞培养法
角膜基质细胞可从角膜实质层获得
角膜内皮细胞培养：眼角膜缘环形剪下角膜,将角膜内皮和后弹力层撕下,分离细胞培养法
来源：角膜缘干细胞
胚胎干细胞诱导分化
成体干细胞诱导分化、（皮肤干细胞、骨髓间充质干细胞、口腔粘膜上皮细胞）
细胞因子
碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）：可促进角膜细胞增殖
角膜细胞生长因子(KGF):可藉此角膜细胞产生多型胶原
转化生长因子（TGF-β1):可使角膜细胞增殖和迁移，促进蛋白合成
表皮生长因子（EGF）:促进细胞增殖
支架材料
良好的生物相溶性，自身及其降解产物对机体无毒性，不引起排斥反应和炎性反应，不致畸变。
材料携带具有生物诱导性的多种角膜细胞生长因子，可诱导自体多种角膜细胞沿材料支架生长繁殖。
支架材料的降解速率与植入角膜细胞形成组织器官的速率想匹配，在支架完成为角膜组织提供模板功能后,可被完全降解吸收，或成为与新生组织相互融合的组成部分。
可按角膜组织的特点和缺损情况进行塑形，形成一定的曲率，达到完善的形态修复.
具有一定的坚韧性和与人体角膜相似的各种物理和化学特性，可加工成型,能形成三维立体结构,为细胞在支架中生长和物质代谢提供足够的空间。
动物胶原和壳聚糖、黏多糖
组织工程扔角膜的重建
首先,角膜基质细胞被种植在胶原凝胶中构建出了类似于角膜基质的中间层；再应用：气-液界面法“,将角膜上皮细胞种植在凝胶上，构建出了上皮细层；由角膜内皮细胞构建下层类似于角膜的内皮层；急性期后在体外得到了透明的组织，与人的角膜极为相似。
分理处角膜主要的3层细胞：内皮细胞、基质层角膜细胞、上皮层细胞
上皮重建:角膜缘干细胞,以羊膜为载体
基质重建：维持角膜的透明性，角膜基质细胞
内皮重建：角膜内皮细胞，以去上皮的羊膜基底膜为载体
皮肤组织工程
种子细胞
体细胞—角质形成细胞（角朊细胞) -——成纤维细胞
干细胞-表皮干细胞 ——-毛囊干细胞 --—骨髓间充质干细胞
目前组织工程所采用的表皮细胞大多为自体细胞。但由于自体细胞的数量及增值能力有限，需要3,4周的培养时间，对于继续覆盖创面的大面积烧、创伤患者，显然无法满足治疗需要。
解决方案：缩短体外培养时间
提高细胞增殖能力
降低细胞抗原性
加入维生素或降低培养环境的温度与湿度
基因转染技术
成纤维细胞的立体培养模式
支架材料
明胶/硫酸软骨素/透明质酸
胶原和壳聚糖
明胶和葡聚糖
PLGA—胶原
聚乙内酯(PCL）/胶原
生长因子
PDGF：是间充质细胞的有力的激活剂，能加速细胞外基质沉积
TGF—β：是细胞生长、分化和细胞外基质形成的多功能调节剂
FGFs:对细胞增殖、分化、迁移的调节
VEGF：在皮肤移植早期诱导产生,形成纤维素凝块并产生暂时的基质以促进血管化
EGF是促进上皮形成的有力的刺激剂
组织工程皮肤通常可分为表皮替代物，真皮替代物和复合皮肤替代物3种类型.