肝糖原的提取、鉴定与定量-实验报告-第四实验室.doc

生物化学实验报告
姓 名:
学 号：
专业年级： 2015级护理本科
组 别: 第四实验室
生物化学与分子生物学实验教学中心
实验名称
肝糖原的提取、鉴定与定量
实验日期
2016-12-20
实验地点
第四实验室
合作者

指导老师

评分

教师签名

批改日期

一、实验目的
1、了解肝糖原提取、糖原和葡萄糖鉴定与蒽酮比色测定糖原含量的原理和注意事项，掌握其操作方法。
2、了解离心管和分光光度计使用的原理并掌握操作步骤.
3、熟悉吸量管、可调式微量移液器的操作步骤。
4、熟悉溶液的转移操作；熟练运用溶液混匀的各种方法(视具体情况，采用合适的混
匀方法）.
5、了解呈色反应。
二、实验原理
(一） 肝糖原的提取与鉴定
1。糖原的分离
采用研磨匀浆使细胞破碎，用低浓度的三氯醋酸使蛋白质变性，破坏肝组织中的酶从而使其沉淀，而糖原仍稳定保持在上清液中，从而使糖原与蛋白质等其他成分分离开来。糖原不溶于乙醇而溶于热水，故用95％乙醇溶液将糖原沉淀，再用热水溶解。
2。糖原的鉴定
（1）糖原螺旋链吸附碘分子:
糖原水溶液呈乳样光泽，其长链形成的螺旋中，依靠分子间引力吸附碘分子，呈现出红棕色。
(2）呈色反应——利用葡萄糖的还原性：
CuSO4+2NaOH = NaSO4 + Cu(OH)2↓
‚2Cu（OH)2 + C6H12O6 = 2CuOH + 氧化型葡萄糖+ H2O
ƒ2CuOH = Cu2O↓(红色) + H2O
④Cu(OH）2 = C u O ↓(黑色）+ H2O
(二）肝糖原定量测定
1.糠醛衍生物的生成及其性质
糖原的水解产物葡萄糖可以在浓硫酸的作用下生成糠醛衍生物-5-羟甲基呋喃甲醛，其可以和蒽酮生成蓝色的化合物，该物质在620nm处有最大吸收.
2。标准对照法进行定量
糖含量在10μg~100μg,溶液颜色的深浅与可溶性糖的含量成正比,利用此反应与同样处理的已知葡萄糖含量标准溶液比色，通过标准对照法即可计算出样品中糖原的含量。
三、 材料与方法：
（一）肝糖原的提取与鉴定
1.实验材料：(1）样品：鸡肝
化钠溶液、班氏试剂、碘试剂

（2）试剂：5％三氯乙酸溶液、95％乙醇溶液、蒸馏水、浓盐酸、50％氢氧
（3）仪器和器材：剪刀、天平、镊子、圆纸片、研钵、试管、离心机、刻
度吸量管（移液管）、微量可调取液器（加样枪）、滴管、白瓷反应板、试管架、恒温水浴箱

2. 实验流程
鸡肝约1。5 g，剪碎

＋5％CCl3COOH 1 ml

研磨至乳状

＋5%CCl3COOH 3 ml
研磨成肝匀浆

全部转入离心管中,离心3分钟(4000 r / min）

沉淀(弃去） 上清（取3 ml）

＋3ml 95%乙醇，混匀,静置10分钟

离心5分钟（4000 r / min）

上清(弃去） 沉淀
＋蒸镏水1 ml

沸水浴2分钟,溶解沉淀

白瓷板孔穴中 糖原溶液1ml
＋浓HCl 5滴

加碘试剂2滴 加碘试剂2滴 沸水浴15分钟，冷却

糖原溶液2滴 ＋50%NaOH 5滴

呈色对比 糖原水解液2滴 糖原水解液

＋班氏试剂4滴
混匀

沸水浴2分钟，观察变化
3. 实验步骤
步骤
操作
（1)肝匀浆准备
称取肝组织约1.5g，放入盛有1ml5%三氯醋酸的研钵中,将肝组织磨至乳状后，再加入5％三氯醋酸3ml，在磨成肝匀浆，4000r/min离心3min，上清液倾入另一干净离心管中。
（2）提取糖原
向上清液中加入等量的95%乙醇,混匀，静置10min，离心5min（4000 r/min)。倾去上清液,白色沉淀为糖原。加入蒸馏水1ml，并加热使沉淀溶解，溶液呈乳样光泽。
（3）糖原鉴定
与碘反应：取碘试剂2滴于白瓷板孔穴中,加糖原溶液2滴，观察其呈色。另一孔穴只加碘试剂2滴，作呈色对比.
糖原水解液汇总葡萄糖的鉴定：取糖原溶液1ml于小试管汇总,加浓盐酸5滴，置沸水浴中水解15min,取出冷却.用50%NaOH中和（约5滴）。另取一小试管加班氏试剂4滴，加上述糖原水解液2滴混匀,在沸水浴中(或直接在酒精灯上)加热2min，观察并记录所见
（二)肝糖原定量测定
1.实验材料:（1）样品：鸡肝
(2）试剂：30％氢氧化钾溶液、蒸馏水、标准葡萄糖溶液、蒽酮显色剂
管）、微量可调取液器（加样枪）、滴管、试管架、恒温水浴箱、分光光度计、100ml容量瓶

（3）仪器和器材：剪刀、天平、镊子、圆纸片、试管、刻度吸量管（移液
2.实验流程
鸡肝0。15 g

＋30％KOH 1.5ml （用吸量管）

沸水浴15分钟

冷却,全部转入100 ml容量瓶中

加水至标线，仔细混匀，此为糖原提取液

糖原的测定
3. 实验步骤
见下表
步 骤
操作
(1) 糖原提取
在试管中加入30％KOH1.5ml，在称取0.15g肝组织放入试管中，置沸水浴中15min。取出后冷却，将管内容物全部移入100ml容量瓶，定容，摇匀。
(2) 糖原的测定
取3支试管，按下表操作：
试剂（ml）
空白管
标准管
样品管
蒸馏水
1。0
-
—
标准葡萄糖溶液
—
1。0
—
糖原提取液
-
—
1。0
0。2％蒽酮溶液
2。5
2.5
2.5
混匀，沸水浴10min,冷却。
混匀，沸水浴10分钟,冷却c.在分光光度计620 n m波长处,用空白管溶液调零,测定各管溶液的吸光度（A)。
计算公式如下：
肝糖原(g/100 g肝组织） =
A样品
×0。05 ×
100
×
100
×1.11
A标准
肝组织重(g)
1000
（三）注意事项
1.肝糖原的提取与鉴定：
（1） 肝糖原提取一步,向上清液中加人等量的95％乙醇后,务必注意混匀。由于最终混合液比较多，混匀操作比较困难，最好用倾倒混匀，或用玻璃棒搅拌混匀.
（2） 糖原中葡萄糖螺旋链吸附碘产生的颜色与葡萄糖残基数的多少有关。肝糖原分枝中的葡萄糖残基在20个以下，吸附碘后呈现红棕色。
（3） 糖原水解液中葡萄糖的鉴定一步，加班氏试剂不能过量，否则反应液呈黑色浑浊，观察不到应有的结果。
（4）离心时，一定要注意对称，质量配平，若听到离心机声音过大，应立即停止离心。
2。肝糖原定量测定
（1）肝组织必须定量，精确，因为要涉及到后期的计算。
（2）肝组织必须在沸水浴中全部溶解，否则影响比色。
（3）注意定量转移，取量务必准确。
(4）蒽酮含有浓硫酸，转移需用刻度吸量管。
（5)若肝糖原含量小于1%，须改用间接测量法，即肝组织消化后，用95%乙醇沉淀糖原。
四、实验现象：
（一）肝糖原的提取与鉴定
1.肝匀浆离心3min后（在取了上清液后才拍照，导致上清液看起来有点浑浊)

图1 肝匀浆离心3min后的分层现象
2. 取3ml上清液向其中加入3ml 95％乙醇后,溶液呈淡黄色

图2 加入乙醇后的上清液

3。鸡肝上清液经乙醇处理,离心后可看到少量白色沉淀物（表明有一定的糖原含量）
2滴碘液+2滴蒸馏水
2滴糖原溶液+2滴碘液

4.在白瓷板孔穴中,2滴糖原溶液滴加2滴碘液后,对比2滴碘液加2滴蒸馏水，有变化，有红棕色物质生成，说明有糖原生成,现象如下图:
图3 呈色对比
5. 糖原溶液加入班氏试剂后呈清蓝色，水浴2min,颜色变化，但未出现砖红色沉淀

图4 左边是水浴之前 右边是水浴之后

（二） 肝糖原定量测定
1.0。15g鸡肝加入KOH溶液再水浴15min，拿出后溶液呈现浅棕红色

图5 鸡肝中加入KOH溶液并沸水浴后现象
2。将鸡肝溶解液移入容量瓶,加蒸馏水至刻度线混匀后，溶液呈浅米黄色。

3。三支试管，从左边到右边依次是空白管，标准管和样品管,并且都加有2.5ml的蒽酮溶液。加入蒽酮溶液时，试管迅速温度升高，液体上层有蒸腾的现象。配置空白管、标准管、样品管时,溶液均有放热现象。
图6 加蒽酮试剂的糖原溶液水浴后颜色
图六左边数起第一支试管是空白对照（蒸馏水+0。2％蒽酮溶液）的结果，溶液呈黄色（稀释后的蒽酮溶液的颜色）;左边数起第二支试管是标准葡萄糖溶液+0.2％蒽酮溶液的结果，溶液为绿色（黄色加蓝色的结果)；左边数起第三支试管是糖原提取液+0.2％蒽酮溶液的结果，溶液为黄色，与空白对照的结果颜色相近.
五． 结果与讨论
（一） 实验数据处理
1、 在肝糖原定量测定中，所取鸡肝组织为0.15g.
2、3支试管在620nm波长处的吸光度（取平均值)
测定次数
各管吸光值A620
空白管
标准管
样品管
1
0
0。620
0。043
2
0
0.621
0。037
3
0
0.620
0。032
各管平均值A(—)620
0
0.620
0。037
3、 按照实验原理中给出的公式,计算鸡肝组织中肝糖原的含量：
肝糖原（g/100 g肝组织） =
A样品
×0。05 ×
100
×
100
×1.11
A标准
肝组织重(g）
1000
代入数据有：
肝糖原（g/100 g肝组织） =
0.037
×0。05 ×
100
×
100
×1。11
0.620
0.15
1000
即待测肝中，每100g组织中肝糖原含量为0.221g/100g肝组织。
（二） 结果讨论
1. 肝糖原的提取与鉴定
（1） 鸡肝上清液经乙醇处理，离心后可看到极少量白色沉淀
结论:存在微量糖原.
（2） 在加入碘试剂进行呈色对比时,可观察：加入碘试剂后的糖原溶液，颜色发生变化,呈现红棕色,比碘液本身的颜色深，但是变化不明显
结论：存在微量糖原。
（3） 在利用班氏试剂鉴定糖原水解液中葡萄糖时，加入班氏试剂的糖原水解液呈现浅蓝色，水浴后，颜色发生变化，但是没有出现预期的砖红色沉淀，反而蓝色更浅了.
结论：未出现砖红色沉淀，说明没有葡萄糖，间接说明没有糖原.
分析（1）（2）（3)的原因：鸡肝样品的质量较少，导致所含的肝糖原较少;
‚对比本实验室其他组的实验结果，同样没有出现砖红色 沉淀，可能的原因有：实验室所用的鸡肝不是新鲜的鸡肝，而是保存了一段时间，导致肝糖原因此而减少；在进行沸水浴的过程中，经常打开锅盖造成温度降低，达不到一定温度.
2. 肝糖原的定量
（1） 结果：该样品中肝糖原含量为每100g肝组织含肝糖原0。221g.
(2)结论：查书可得饱食鸡肝肝糖原含量为2～3g/100g肝组织。在本组实验中测得肝糖原数值小于正常范围值，未达到预期的实验结果。但对比本实验室其他组别，所求值同样偏小,可见鸡肝组织本身含肝糖原很少。