肝糖原的提取、鉴定与定量-实验报告-第四实验室.doc
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1、生物化学实验报告姓 名: 学 号: 专业年级: 2015级护理本科组 别: 第四实验室 生物化学与分子生物学实验教学中心实验名称 肝糖原的提取、鉴定与定量实验日期2016-12-20实验地点第四实验室合作者指导老师评分教师签名批改日期一、实验目的1、了解肝糖原提取、糖原和葡萄糖鉴定与蒽酮比色测定糖原含量的原理和注意事项,掌握其操作方法。2、了解离心管和分光光度计使用的原理并掌握操作步骤.3、熟悉吸量管、可调式微量移液器的操作步骤。4、熟悉溶液的转移操作;熟练运用溶液混匀的各种方法(视具体情况,采用合适的混 匀方法).5、了解呈色反应。二、实验原理(一) 肝糖原的提取与鉴定 1。糖原的分离采用研
2、磨匀浆使细胞破碎,用低浓度的三氯醋酸使蛋白质变性,破坏肝组织中的酶从而使其沉淀,而糖原仍稳定保持在上清液中,从而使糖原与蛋白质等其他成分分离开来。糖原不溶于乙醇而溶于热水,故用95乙醇溶液将糖原沉淀,再用热水溶解。 2。糖原的鉴定 (1)糖原螺旋链吸附碘分子:糖原水溶液呈乳样光泽,其长链形成的螺旋中,依靠分子间引力吸附碘分子,呈现出红棕色。 (2)呈色反应利用葡萄糖的还原性: CuSO4+2NaOH = NaSO4 + Cu(OH)2 2Cu(OH)2 + C6H12O6 = 2CuOH + 氧化型葡萄糖+ H2O 2CuOH = Cu2O(红色) + H2O Cu(OH)2 = C u O
3、(黑色)+ H2O(二)肝糖原定量测定 1.糠醛衍生物的生成及其性质糖原的水解产物葡萄糖可以在浓硫酸的作用下生成糠醛衍生物-5-羟甲基呋喃甲醛,其可以和蒽酮生成蓝色的化合物,该物质在620nm处有最大吸收. 2。标准对照法进行定量糖含量在10g100g,溶液颜色的深浅与可溶性糖的含量成正比,利用此反应与同样处理的已知葡萄糖含量标准溶液比色,通过标准对照法即可计算出样品中糖原的含量。三、 材料与方法:(一)肝糖原的提取与鉴定1.实验材料:(1)样品:鸡肝化钠溶液、班氏试剂、碘试剂 (2)试剂:5三氯乙酸溶液、95乙醇溶液、蒸馏水、浓盐酸、50氢氧 (3)仪器和器材:剪刀、天平、镊子、圆纸片、研钵
4、、试管、离心机、刻度吸量管(移液管)、微量可调取液器(加样枪)、滴管、白瓷反应板、试管架、恒温水浴箱2. 实验流程 鸡肝约1。5 g,剪碎5CCl3COOH 1 ml 研磨至乳状 5%CCl3COOH 3 ml 研磨成肝匀浆全部转入离心管中,离心3分钟(4000 r / min)沉淀(弃去) 上清(取3 ml)3ml 95%乙醇,混匀,静置10分钟离心5分钟(4000 r / min)上清(弃去) 沉淀蒸镏水1 ml 沸水浴2分钟,溶解沉淀白瓷板孔穴中 糖原溶液1ml浓HCl 5滴加碘试剂2滴 加碘试剂2滴 沸水浴15分钟,冷却糖原溶液2滴 50%NaOH 5滴呈色对比 糖原水解液2滴 糖原水
5、解液 班氏试剂4滴 混匀沸水浴2分钟,观察变化3. 实验步骤步骤 操作(1)肝匀浆准备称取肝组织约1.5g,放入盛有1ml5%三氯醋酸的研钵中,将肝组织磨至乳状后,再加入5三氯醋酸3ml,在磨成肝匀浆,4000r/min离心3min,上清液倾入另一干净离心管中。(2)提取糖原向上清液中加入等量的95%乙醇,混匀,静置10min,离心5min(4000 r/min)。倾去上清液,白色沉淀为糖原。加入蒸馏水1ml,并加热使沉淀溶解,溶液呈乳样光泽。(3)糖原鉴定与碘反应:取碘试剂2滴于白瓷板孔穴中,加糖原溶液2滴,观察其呈色。另一孔穴只加碘试剂2滴,作呈色对比.糖原水解液汇总葡萄糖的鉴定:取糖原溶
6、液1ml于小试管汇总,加浓盐酸5滴,置沸水浴中水解15min,取出冷却.用50%NaOH中和(约5滴)。另取一小试管加班氏试剂4滴,加上述糖原水解液2滴混匀,在沸水浴中(或直接在酒精灯上)加热2min,观察并记录所见(二)肝糖原定量测定1.实验材料:(1)样品:鸡肝 (2)试剂:30氢氧化钾溶液、蒸馏水、标准葡萄糖溶液、蒽酮显色剂 管)、微量可调取液器(加样枪)、滴管、试管架、恒温水浴箱、分光光度计、100ml容量瓶 (3)仪器和器材:剪刀、天平、镊子、圆纸片、试管、刻度吸量管(移液2.实验流程鸡肝0。15 g30KOH 1.5ml (用吸量管) 沸水浴15分钟冷却,全部转入100 ml容量瓶
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