维生素C含量测定的实验设计方案.doc

维生素C含量测定的实验设计方案
一、目的与要求
(1)掌握维生素C的含量测定的原理和操作.
(2)掌握维生素C的分子式和结构简式,了解维生素C的还原性。
(3）掌握紫外分光光度法维生素C含量的测定的方法。
(4)熟悉精密紫外可见分光光度计的使用方法.
（5)掌握用标准曲线法进行定量分析的原理和方法。
二、方法提要
维生素C（Vitamin C ,Ascorbic Acid）广泛存在于新鲜水果中,它具有保持肌肤润滑、防止衰老、抗坏血酸等作用，是人体必需的主要维生素之一，是人体正常生理代谢不可缺少的一类有机物［1]。维生素C在水果中主要以还原型（ASA）存在。维生素Ｃ又名抗坏血酸是一种含有6个碳原子的酸性多羟基化合物,分子式为C6H8O6,分子量为176.1。能溶于水、乙醇和甲醇，而不溶于其他有机溶剂,具有酸性和还原性，有4种异构体，即L-抗坏血酸、D—抗坏血酸、L-异抗坏血酸、D-异抗坏血酸。天然抗坏血酸主要以L—抗坏血酸为主，其效力最高.抗坏血酸在合适的条件下，可氧化成脱氢抗坏血酸，脱氢后的L-脱氢抗坏血酸在生物体内可还原为L—抗坏血酸，且这种变化是可逆的，故仍有生物活性.脱氢抗坏血酸可进一步被氧化,生成二酮古洛糖酸,而这一过程是不可逆的.在许多水果和蔬菜中，维生素C主要以还原型抗坏血酸存在。维生素C的固体较稳定，水溶性最容易受氧化，所以测定VC的准确性很大程度上取决于分析技术。 水果中VC含量的测定一般采用2，6—-二氯靛酚滴定法[2］、碘量法［3]、2，4—二硝基苯肼法[4]、荧光分光光度法[5］高效液相色谱法[6]和点位滴定法［7]等,这些方法都有所用试剂不稳、操作程序复杂、费时等缺点，为此，此实验采用分光光度法［8]，首先测定维生素C的标准曲线,以吸光度差值△A对抗坏血酸浓度C绘制标准曲线，以此为基础测定样品的△A，并求得水果中维生素C的含量.本方法与常规方法比较，具有准确、快速、稳定、试剂易得等优点。
维生素C是烯醇化合物,具有—C=C—基,在可见光区无吸收,在紫外区有吸收。按实验方法,分别对不同浓度的标准维生素C与试剂空白溶液在200～400nm波长范围内进行扫描,通过吸收光谱曲线确定维生素C水溶液的最大吸收波长.又根据维生素C对碱不稳定的特性，于最大吸收波长处测定样品溶液与碱处理样品两者吸收光度之差，通过查标准维生素C的标准曲线，即可计算样品维生素C的含量。这种方法具有准确、快速、重现性好等优点，还适合深色样品的测定。 
    由于维生素C极度不稳定，在样品前处理过程中,防止抗坏血酸的氧化是非常重要的。可采用添加偏磷酸、草酸的方法加以解决.因为它们均能抑制抗坏血酸的氧化酶，而起稳定作用。但由于2％草酸在波长200～400nm处有非常强的吸收，所以不能作为维生素C的提取液，而2％偏磷酸虽然在波长200～400nm处有微弱的吸收，可通过扣除其空白吸光值，便可计算出样品维生素C的吸光值差ΔA。因此，本实验选择2%偏磷酸作为分光光度法的溶剂。
（本实验采用紫外分光光度法）
三、试剂与仪器
（1）试剂：标准抗坏血酸溶液（0。1mg/mL)：精确称取抗坏血酸10mg（精确至0.1mg）， 用2％偏磷酸溶解并定容至100mL，此溶液应贮存在棕色瓶中，最好现配现用;
2%（W/V）偏磷酸溶液，0。5mol/mLNaOH，
（2）仪器：紫外—可见光光度计、石英比色皿、组织捣碎机、高速离心机、50mL容量瓶、100mL容量瓶、10mL移液管、洗耳球、10mL比色管、电子天平.
四、操作步骤
1、样品制备
取水果样品400 g清洗、沥干,将每份样品平均分成4份，即每份100 g,用破碎机破碎。加入100mL2.0%偏磷酸溶液,迅速捣成匀浆。称取 31。5g浆状样品，用2.0％偏磷酸将样品移入100mL容量瓶中，并稀释至刻度,摇匀。有浑浊现象，用高速冷离心机离心，7500rpm，离心10min，取其上清液。
2、绘制标准曲线
吸取0。00、0.20、0.40、0.80、1。00、1。20mL抗坏血酸标准溶液,置于10mL比色管中;用2%偏磷酸定容，摇匀。此标准系列抗坏血酸的浓度分别为0。00、1。00、2.00、4。00、6.00、8.00、10。0、12。0μɡ/mL。以蒸馏水为参比，在波长λmax（经测定,最大吸收峰所对应的入射光波长λmax=245nm)处，用1cm石英比色皿测定标准系列抗坏血酸溶液的吸光度。抗坏血酸吸光度为A,试剂空白吸光度为A.,计算吸光度差值△A=A-A.，以吸光度差值△A对抗坏血酸浓度C绘制标准曲线。
3、样品的测定
准确移取澄清透明的0。4mL的提取液，置于10mL的比色管中，用2。0%偏磷酸溶液稀释至刻度后摇匀。以蒸馏水为参比，在波长λmax处，用1cm石英比色皿测定其吸光度.每个样品做三次重复.
待测碱处理样溶液的测定：分别吸取0。4mL澄清透明提取液，加入6滴0。5mol/L的NaOH溶液,置于10mL比色管中混匀，在室温放置40min后,加入2.0%偏磷酸溶液稀释至刻度后摇匀。以蒸馏水为参比，在波长λmax处，用1cm石英比色皿测定其吸光度.每个样品做三次重复。
4、结果计算
由待测样品与待测碱处理样品的吸光度值之差校准曲线，即可计算出样品中维生素C的含量,也可以直接以待测碱处理液样为参比,测得待测液的吸光值，通过查校准曲线,计算出样品的维生素C的含量. 
           维生素C的含量mg/100g=﹙200×C) ／﹙m×V﹚ 
式中: m——样品重量（g）；      
 200-—稀释倍数； 
       C——从校准曲线上查得抗坏血酸的含量，μɡ/mL；       
V-—测试时吸取提取液体积,mL.
五、注意事项
（1）在优化的实验条件下得到的校准曲线，表明维生素C在1。00～12.0μɡ/mL范围内吸光度与浓度C之间呈良好的线性关系服从朗伯比尔定律。所以测定的最大吸光度值最好不要超过0。8A，否则浓度过高易造成曲线的弯曲。 
（2）要求每批测定样品都要有校准曲线。 
（3)在处理药品时，如遇到泡沫产生,可加入数滴辛酸消除。 
（4）若样品浑浊，可用离心机分离用转速7500rpm，时间10min,至样液澄清、透明，取上清液. 
(5）一般分析纯抗坏血酸纯度为99%以上,可不标定，若试剂发黄,则弃去不用。
六、思考题
1.
2.
参考资料网址
http：//
http://wenku。baidu。com/link?url=a7Fgx2jHHOoHpCQgnhZwwV9LCtIFlimDNhQJ_-O0IZUBcvqoV5SZr-_X4RX5AN_kwUBkPFP0w-kF49yEAs8gGZRpI6AVImpBaizobyIFrha
http：//wenku.baidu。com/view/86856136ee06eff9aef80741。html?re=view
http：//baike.baidu。com/link？url=pWkRhgBR—yyEfltVdSFXLc6UMT1qSIkJUBpx1HyJsVfvGqFlFkrNbAzbxIWCdRw1xl80ZQV9FXu1E1adpLvofq