蛋白印迹操作流程.doc
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1、蛋白印迹操作流程蛋白印迹,也称Western,Westernblot、Westernblotting、Western印迹,简称WB,是用免疫学方法检测蛋白,研究蛋白质的表达调控的重要方法之一。蛋白印迹可以参考如下步骤进行操作. 1.蛋白样品的制备(Proteinsamplepreparation) 可以选用适当的裂解液,如赛驰生产的WIP细胞裂解液,裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。对于某些特定的亚细胞组份蛋白,例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等,可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白,也可以使用试剂盒进行抽提,如赛驰生产的细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒。 为确保每个蛋白样品的上样量一
2、致,收集的蛋白样品均应测定其蛋白浓度。蛋白浓度的测定方法,应根据组织细胞裂解或匀浆所使用的方法及裂解液的不同选用,因为去垢剂和还原剂等对不同蛋白浓度测定方法的影响差别很大。如使用我公司生产的WIP细胞裂解液,可以使用BCA蛋白浓度测定试剂盒。 2.电泳(Electrophoresis) (1)SDSPAGE凝胶配制 SDS-PAGE凝胶可以参考文献资料进行配制,也可以使用赛驰生产的SDS-PAGE凝胶配制试剂盒。该试剂盒提供了除水和配胶器具外的所有试剂以及配制各种浓度SDSPAGE的配方。 (2)样品处理 在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDSPAGE蛋白上样缓冲液,放置于水漂上于100或沸水
3、浴中加热3-5分钟,以充分变性蛋白。使用浓缩的蛋白上样缓冲液可以减小上样体积,在相同体积的上样孔内可以加入更多的蛋白样品。蛋白上样缓冲液可以参考相关文献资料自行配制,也可以使用赛驰生产的SDSPAGE蛋白上样缓冲液(5X)。 (3)上样与电泳 冷却到室温后,把蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可电泳,电泳缓冲液可以参考相关文献资料自行配制,也可以使用赛驰生产的SDSPAGE蛋白电泳缓冲液(10X).为了便于观察电泳效果和转膜效果,以及判断蛋白分子量大小,最好使用预染蛋白质分子量标准。电泳时通常在上层胶时使用低电压恒压电泳,而在溴酚蓝进入下层胶时使用高电压恒压电泳。对于标准电泳装置或
4、类似电泳装置,低电压可以设置在80-100V,高电压可设置在120V左右。 采用普通的电泳仪就可以满足SDSPAGE电泳的要求,也可以采用赛驰提供的多功能电泳仪。为方便起见,也可整个SDSPAGE电泳过程均采用恒压的方式,通常把电压设置在100V,然后设定时间为90120分钟.设置定时可以避免经常发生的电泳过冲。 通常电泳时溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳,或根据预染蛋白质分子量标准的电泳情况,预计目的蛋白已经被适当分离后即可停止电泳. 3。转膜(Transfer) 在Western实验中,我们推荐选用PVDF膜,也可以使用硝酸纤维素膜(NC膜),但硝酸纤维素膜比较脆,在操作过程中特别是用
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