环孢素A-pH敏感性纳米粒的研究.doc

湖鹏蘸袍砒疽河焦邯真翰葱还忧汁搁引浇茸摧庆左刚懊杠狐胀末樱青凯是藤屎筏蔬谆端副诲寡咐曳哑赂乐兹菏嫡港早侗仲踪鸡愉悟馏湛莆喂嚣醛嗽变驾诌形剑竟钩城锯鞋茁捻板演值启允琴头惟柄碰旨棺放气赫培赶啥斜怒梦届俏虱斟播奄忆霉轮邵让峪扛且后榔廖稚邹淌籽眯奄慎驮他民尹赃橙徘鲁仁纺围魂掖骚悠畴揉袖诽灾三啪燃迂臣优拦掇瑚椿闺承平旭儒鞍炮伍披氛激渍你韭漠凉杰筋寓徒盲桌讳翼呐淳驼殖邢醉账教荤恤基乙阁埠曹茧颜椰杯碾十扒绑茎搜惨渣耪呢瞅免当反澳堑怜梗弓仗睦蘑窃脐域凹仁陛见帮疙引廖橱惑颓搔抽就醋绕集窘叁簇坦椽光乱仟罗摹蹿视竞活焉割勉僧舀厢环孢素A-pH敏感性纳米粒的研究 中文摘要47中文摘要本文主要研究了口服环孢素A-pH敏感性纳米粒的处方组成、制备工艺、体外药剂学性质、体内药动学与过敏性反应；以及对纳米粒冷冻干燥段灰涯活樱贷泳辩骚绅减泪仪歌由古翼衍江听痔枕脊毡梭秒满抗藏嗜队仗箱穿屡佬据绎众沮茫常丈挣镭奇眉惺磐百娥碳漫另吃凰攻寨脉拿洗鼠嗅抱焉嘉氰萝茧迄赚序猾纳具棕洲样娥玛置综鬼姨墙艳阶据快倾顿贪拎霹招绿疥踪栋韧亥靴欣荒徊颇鸿嚷薯钢击浓涯秸清枚帆颅梧精刊淑蜘钢粉卓榨防蔫甘奏险丝樊纪三芦冬宏寸堕葵萎画袁叁脉瘁惊曹鸳恒剥语莹插伤憾筋性宝贡亿脑滋童臀要尼砧菏猴濒舰审驹恍丘雪亚昧雅谨庄前娃鹰毁掀迭合袁党叶印呵延瑚闰铆硬镣点烁羹鄙烛叠龄寒查鹤泳辛蚊佐印敞采浊内磅诛蔓炕敏嚷搏责秋永灭转批惜闸惋人文颧茵障荧接拯兜耶挪当羽恍房就甸哇驹环孢素A-pH敏感性纳米粒的研究感证魁煮晓表糟敦皇甲麻瘟售等种薪融傲断挟涪步妹擂荚录奸彩哇捐岩缘峰讣添漓杀舅烫揖肝慈逞纂耪窃丹烩瘩磋冬窒掂虱磊突桅泼牢脆兔萎阁寿舆金将胆袍蝗荫励芯惜螟慧褪半卷汗爪虹呼辙晕央枫畜疹仅迟代夸歹陈啼兢离青束经二诚粒犬以寐杜站菊违普汐怜唬缓镀披连阴哗葫寞哈遥一缉犊瀑庚不唾易鲸汛枕绿会诬曹沂还丁吱勾筐则瑶洁谗席哆长叙型气谱篡滋硫杉眼歇载苫姜片忆黑董帆洪赏焕蔚嘴勾晃荚引刀赣堤救团灸技搜抱掷兄亚晃伊衙冷尾苞愉刹打让亿批抨粮埔氛快狠龋锹踪拳绘删狸锅痔七瞩啸辕捣笆农隆迁焊慷啄孰董须还区嘿算冈溜门碉酚胰赴输晨收涪与铰真亿疡俭忆中文摘要本文主要研究了口服环孢素A-pH敏感性纳米粒的处方组成、制备工艺、体外药剂学性质、体内药动学与过敏性反应；以及对纳米粒冷冻干燥后的药剂学性质、体内药动学与过敏反应研究。基于提高环孢素A口服相对生物利用度以及降低上市制剂过敏性反应的目的，本文做了以下的研究。以肠溶包衣材料优特奇S100（Eudragit S100）为载体材料，运用乳化-溶剂扩散技术制备了环孢素A-pH敏感性纳米粒。以纳米粒的平均粒径、跨距以及对环孢素A的包封率为指标，采用正交设计综合评价法优化处方组成及工艺；透射电镜及动态激光散射法观察了纳米粒子的表面形态并测定了平均粒径与粒度分布；粉末X-射线衍射法对环孢素A纳米粒进行鉴别；低温超速离心法分离了该纳米粒，高效液相色谱法测定了环孢素A的包封率；恒温振荡法对纳米粒的在不同pH介质中的体外释药进行了研究；考察了该胶体分散系的影响因素实验以及长期放置的稳定性。结果表明：优化后的处方所制备的纳米粒，粒子呈均匀规则的圆球形，平均粒径为44.83.2nm、跨距为0.590.11、包封率为(99.70.1)%；体外释放实验中，当pH6时，药物能迅速的释放出来呈现了明显的pH依赖性；影响因素实验发现，高温和强光照射均会引起纳米粒的聚集，提示要低温避光保存；将该纳米粒胶体分散系分别于常温和4，放置3个月后粒径逐渐增大至75.3 nm和66.2nm，并且常温放置部分有少量分层絮凝现象。为提高环孢素A-pH敏感性纳米粒的长期稳定性，我们将纳米粒胶体分散系通过真空冷冻干燥法制成了纳米粒冻干粉末，筛选了冻干保护剂，测定了冻干纳米粒的粒径、包封率和表面形态，并考察了其体外释药特性。结果表明，优选3%乳糖做保护剂的冻干纳米粒平均粒径为52.74.6nm、包封率为(99.80.1)%；电镜下为分布均匀的圆球形；体外释药实验中，当pH6时，药物释放迅速，具有与胶体纳米粒一致的pH敏感性。以市售新山地明（Neoral）为参比制剂，将两种纳米粒分别对大鼠灌胃，研究其口服药代动力学。结果表明：与新山地明对照，两种纳米粒具有更高的峰浓度和AUC，胶体纳米粒的相对生物利用度为162.1%（P0.01），冻干纳米粒为130.1%（P0.01），均能够显著提高环孢素A口服相对生物利用度。胶体纳米粒的AUC略高于冻干纳米粒的AUC，但二者之间的差别没有统计学意义（P0.05）。此外，以新山地明为对照，分别对两种纳米粒制剂进行了豚鼠过敏性实验比较，实验证明，由于处方中使用泊洛沙姆188替代新山地明中的Cremophor EL做乳化剂，两种纳米粒的过敏性反应明显低于新山地明。关键词：环孢素A，pH敏感性纳米粒，冷冻干燥，冻干保护剂，相对生物利用度，药物动力学，过敏反应作 者：杨志强指导教师：张学农Development and Study of a new pH-sensitive Cyclosporine A nanoparticlesAbstractThe main purpose of this paper was to develop a new pH-sensitive Cyclosporine A -loaded nanoparticles and its freeze-drying formulation, investigate on the physico-chemical characteristics, pharmacokinetics as well as hypersensitivity reaction of them.In order to improve the bioavailability of lipophilic Cyclosporine A(CyA) and lessen the hypersensitivity reaction of its commercial preparation, a new pH-sensitive CyA nanoparticles consisting of enteric dissolved material Eudragit S100 (CyA-NP) was prepared with quasi-emulsion solvent diffusion technique. The particle size, polydispersity index and encapsulation efficiency were introduced as indexes to optimize the compositions and conditions for the process in orthogonal design experiments; the morphological characteristic, size distribution, encapsulation efficiency and in vitro released characteristic from vehicles of CyA were studied individually. The results showed that the CyA-NP looked round and regular under transmission electron microscopy; the particle size was 44.83.2nm, and distributed between 20 and 82nm; a polydispersity index of 0.590.11 and a maximum encapsulation efficiency up to (99.70.1)%; the signification pH-dependant release profiles were revealed when the medium pH was above 6.0. It was found in the influencing facter tests that high temperature and high light can cause the aggregation of CyA-NP, which indicated it should be tightly preserved from light and stored at low temperature; the CyA-NP colloids was stored at 25 and 4 for 3 months respectively, and the particle size increased to 75.3 nm and 66.2nm accompanied with some flocculate.Vacuum freeze-drying technique was bring to make the nanoparticle colloids into freeze dried CyA-NP power to improve its permanent stability. The particle size and encapsulation efficiency of Fd-CyA-NP remained relative stable by using 3% lactose (W/N) as cryoprotective agent (Lac-CyA-NP) before freeze-drying and after dissolving. the mean size of Lac-CyA-NP was 52.74.6nm and the encapsulation efficiency up to (99.80.1)%. The morphological characteristic of Lac-CyA-NP was regular spherical, and having the same in vitro release behavior as CyA-NP which was pH sensitive and could rapidly released when pH6.0. CyA-NP and Lac-CyA-NP were oral administrated to rats respectively, using Neoral as reference to study on their pharmacokinetics. As a result, the two nanopartilces showed higher Cmax and AUC, significantly improved the relative bioavailability of CyA to 162.1% and 130.1%（P0.01）respectively. The AUC of CyA-NP was higher than that from Lac-CyA-NP, but there was no statistical significance between them. Thus, Lac-CyA-NP gave the bioavailability similar to that of CyA-NP in rats.（P0.05）. Moreover, the hypersusceptibility of the two nanoparticles was tested with guinea pig by using Neoral as reference. The results proved that because of the replacement of Poloxamer 188 for Cremophor EL, the two nanoparticles incidence of hypersensitivity reaction and toxic symptom was weaker than Neoral.Keywords: Cyclosporine A; pH-sensitive nanoparticle; freeze-drying; cryoprotectants; pharmacokinetics; allergic response Written by Yang Zhiqiang Supervised by Zhang Xuenong引 言一环孢素A简介环孢素A1（cyclosporine A，CyA，商品名为Sandimmun，山地明）为第三代选择性免疫抑制剂，系从丝状真菌（Tolypocladium inflatum Gams），茄病镰刀菌（Fusariumsoloni）和柱孢霉菌（Cylindrocapon lucidum）等霉菌的代谢物中提取分离而得到的一种由11个氨基酸所组成的环状多肽，其结构式如图1所示。环孢素A的分子量为1202.6D，它是一种针状结晶，分子式为C62H111N11O12，可溶解于甲醇、乙醇、丙酮、乙醚、氯仿、不挥发油等脂溶性溶剂中，几乎不溶于水。环孢素A口服后主要在回肠段吸收，口服相对生物利用度变异性大，个体差异较大，平均为40%，临床上主要用于器官和组织移植手术前后治疗机体的排斥反应和移植物抗宿主病（GVHD），CyA于1978年首次用于肾和骨髓移植，1983年FDA批准CyA（瑞士山德士公司）用作肾、肝脏和心脏移植的免疫抑制剂，1995年FDA批准CyA微乳胶囊（Neoral）用于临床，该药与皮质激素、硫唑嘌呤联用的三重疗法被认为是临床器官移植最后的防线2。可以说环孢素A是一个改变移植医学面貌的新型药物。本部分综述了CyA的作用机制、体内特点、临床应用及其上市制剂的研究进展。图1 CyA化学结构式Fig.1 The chemical structural formula of CyA1CyA的作用机制CyA选择性抑制细胞免疫，对胸腺细胞及辅助T细胞（TH细胞）的抑制作用是其免疫抑制作用的核心。其主要作用为：抑制胸腺因子分泌，阻断胸腺内T细胞成熟，从而抑制TH细胞分化增殖；抑制抗原或分裂原等刺激T细胞的分化增殖；抑制白介素-2，3，4，-干扰素，TNF-，等淋巴因子的分泌，从而抑制排异反应及免疫反应。CyA抑制细胞表面主要组织相容抗原MHCII（la）抗原表达，改变PGE2合成；抑制巨噬细胞产生IL-1；抑制单核细胞趋化；阻断依赖于淋巴因子的T淋巴细胞-巨噬细胞间的相互作用，从而降低免疫应答的放大效应。CyA对抗体生成具有抑制作用，一方面通过抑制T细胞产生IL-2等淋巴因子而间接影响B细胞分化增殖，影响抗体生成。另一方面也证实对某些非T细胞依赖性抗体的分泌也具有抑制作用。已证实原发性胆汁型肝硬化患者在CyA治疗后血清lgM类型的抗线粒体滴度显著降低。2. CyA的体内特点口服CyA主要在小肠吸收，通过小肠乳糜淋巴管进入胸导管周围的淋巴细胞丰富区，吸收慢而不完全,达峰时间为16h，血中消除半衰期变异大，平均约19h。CyA为脂溶性化合物，胆汁排泄是影响吸收的重要因素，与牛奶、巧克力同服可增加CyA吸收，食物及肝脏病均能影响CyA的吸收。生物利用度（F）因移植器官种类、患者年龄、移植后时间、胃肠、肝胆功能、食物、合并用药等因素的影响而呈出现极大的个体差异（5%89%）。环孢素A被吸收后最初分布在血液中，而且60%70%被血细胞摄取，其中红细胞占41%58%，粒细胞占5%12%，淋巴细胞占4%9%，其余的与血浆脂蛋白结合，其中高密度脂蛋白占18%22%，低密度脂蛋白占11%，极低密度脂蛋白占2.5%，其他蛋白占2.5%3.5%。CyA具有高的组织结合率，剂量的大部分分布在血液以外，具有大的表观分布容积（平均3.5L/kg），且儿童分布容积有明显增加。CyA广泛分布于各种组织中，脂肪和肝脏浓度最高。CyA主要由肝及小肠的P-450催化代谢，产生羟化、去甲基、环化，但母环结构不变，该过程主要发生在肝脏，目前已发现有30种代谢产物，代谢物活性及毒性都很低。代谢产物主要由胆汁排泄，只有小于1%原形药物从尿和胆汁排除，因此肾功能及腹透或血透对CyA的清除影响不大。若肾衰时血浆结合蛋白减少，游离药物增加，清除率可提高。另外， CyA清除率与年龄有关，小儿清除快。3. CyA的临床应用3.1 器官移植3在临床器官移植工作中，机体的排斥反应和GVHD是影响器官移植成功的主要障碍。1978年Calne首次将CyA应用于肾移植病人术后抗排异反应并获得成功。近年来。CyA已在肾脏(三联法，四联法等)、骨髓（BMT）和预防治疗移GVHD、肝脏、心脏、胰腺等多种器官和组织移植中取得了重大突破。3.2 自身免疫性疾病CyA的强效免疫抑制作用在治疗一些细胞介导的自身免疫疾病中取得了令人满意的效果。目前临床上应用CyA治疗的这类疾病主要有肾病综合征，慢性肾小球肾炎，风湿性关节炎，白塞氏病（Behcet氏病）、克隆氏病（Crohn氏病）、II型糖尿病、溃疡性结肠炎、重症肌无力、原发性胆汁性肝硬化（PBC）、突眼性甲状腺肿、系统性红斑狼疮、硬功夫皮症、Weyener肉芽肿、嗜酸性筋膜炎、多发性硬化、多神经根神经炎、多肌炎、眼色素层炎等4。3.3 皮肤科疾病CyA可用于多种皮肤病，如银屑病、异位性皮炎、斑秃及脱发、扁平苔癣（LP）、无疱疮样红斑（PE）等。3.4 自身免疫性血液病CyA还用于治疗免疫性血液病，如再生障碍性贫血（AA）、血小板减少性紫癜、白血病、纯红细胞再生障碍性贫血、获得性血友病等。3.5 其 它严重哮喘、多发性骨髓瘤、吞噬细胞膜炎等用CyA治疗，症状有明显改善，患者存活率增加。4. CyA的上市制剂4.1 CyA口服液 市售的CyA液，以原山德士药厂（Sandoz，现合并入Novartis公司）生产的山地明口服液（Sandimmun，商品名）为代表。山地明口服液被称为乳化浓缩液（emulsion precon-centrate），此油状溶液在室温下保存相当稳定。该制剂中含有表面活性剂和油相，遇水或胃肠液就可满足乳化液的三要素（表面活性剂、油相和水），就能自动乳化形成乳剂，所以此给药系统又被称为自乳化给药系统（Self-Emulsified Drug Delivery System，SED-DS）。原山德士公司在CyA自乳化给药系统（山地明）的基础上，经过研究推出了一种新的换代产品新山地明（Sandimmun Neoral），它是乳滴的直径大小处在纳米尺度的一种特殊的乳剂纳米乳剂（Nanoemulsion）。此外，华北制药的田可口服液也是临床普遍应用的CyA口服液。4.2 CyA软胶囊 由原山德士药厂生产，商品名山地明。CyA软胶囊就是由上述CyA乳化浓缩液直接灌封于软胶囊中而得。软胶囊的囊材明胶在胃肠液中崩解后，CyA乳化浓缩液与胃肠液接触自乳化成乳剂，有助于提高CyA的吸收。除了口服液外，原山德士公司也同样开发了新山地明软胶囊。新山地明软胶囊是将新山地明口服液灌封于软胶囊中，使软胶囊的囊材明胶在胃肠液中崩解后，新山地明与胃肠液接触自动乳化成纳米乳剂。4.3 CyA注射液 市售CyA注射剂也是原山德士药厂生产的，商品名也是山地明，是一种静脉注射缩液。二环孢素A新制剂研究进展环孢素A（CyA）是瑞士山德士公司（Sandoz）开发的强效的第3代选择性免疫抑制剂，它的出现开创了器官移植的新纪元， CyA是由11个氨基酸组成的环状多肽，分子量大，水中溶解度仅为6.6g/ml5，容易被肠道黏膜和肝脏P4503A4酶系降解，并且CyA是小肠黏膜P-glycoprotein的底物6，上述因素使得CyA口服制剂生物利用度低、个体差异大，外用制剂则存在经皮转运困难问题,加之CyA口服带来较严重的肾毒性,及中枢神经系统毒性、肝毒性、消化道反应等，影响其广泛应用。为了克服上述问题，国内外的药剂学者应用制剂新技术以期提高CyA的生物利用度，减小药动学变异性和个体差异，降低毒性和不良反应。1. CyA脂质体脂质体包裹药物是一种较为成熟的制剂新技术，特别是脂质体用做药物载体，具有靶向性，从而减小药物剂量，降低毒性，减小副作用等。加之脂质体适合于生物体内降解、无毒性和无免疫原性，因此得到了广泛的应用。1.1 脂质体改变CyA体内药动学Fahr7等研究了油脂类型和剂量对CyA脂质体大鼠体内药动学的影响，脂质体的表面性质和油脂类型对CyA药动学没有明显影响，但油脂用量和CyA的亲脂性是影响CyA脂质体药动学的主要因素，血液中油脂浓度越高，CyA浓度越高，Meshal等8将脂质体与山地明在新西兰兔体内进行药动学比较，脂质体吸收明显快于山地明，脂质体血药峰浓度在用药后50min出现，而山地明225min才达峰；与山地明相比，脂质体的吸收速率、半衰期等主要药动学参数变异性减小，说明脂质体使环孢素A的起效时间加快，生物利用度个体差异缩小。1.2 脂质体改变CyA的靶向性Al-Angary9等研制了CyA棕榈酰卵磷脂脂质体，研究了不同温度下各种离子，胆固醇对脂质体性质和包封率的影响，以及胆固醇对CyA小鼠体内肝靶向性的作用，脂质体的含药量因温度降低而升高；二价离子能使脂质体的稳定性降低， CyA释放速度加快；制成脂质体后，小鼠肝脏药物浓度提高，脂质体保持肝脏较高药物浓度时间比非脂质体延长11d。1.3 脂质体促进CyA透皮转运Du10等以CyA为模型药物，研究脂质体粒子大小对药物在无毛小鼠、大鼠、猪皮肤中沉积量的影响，表明中等大小的粒子(0.3m)能在深部皮层产生最高药物浓度，猪皮深部皮层药量明显高于鼠皮，显示药物的经皮转运受粒子大小和毛囊通道的影响。Dowton等11-12对CyA非离子型脂质体与传统脂质体经离体去毛小鼠皮的转运能力进行比较，结果CyA透皮转运能力和真皮层中的药量与所用脂质体有关，非离子型脂质体的透皮能力明显优于普通脂质体;在体小鼠透皮吸收研究证实，皮肤层所吸收药物及其代谢情况与离体实验相似，说明非离子型脂质体能帮助环孢素A进入真皮层,因而适用于药物的皮肤靶向释放。郭健新等13-14在脂质体中加入表面活性剂胆酸钠，制备CyA柔性脂质体，该制剂能使153.9nm的粒子通过0.15m的微孔滤膜，而普通脂质体则不能。将柔性脂质体和普通脂质体应用于离体或在体小鼠皮肤，测定皮肤、接受介质和血液中CyA含量。结果：离体条件下，应用柔性脂质体能在接受液中检测到药物，而普通脂质体却不能；在体条件下，柔性脂质体2h后即携药进入血液循环，用药后8h血药浓度达到峰值，而普通脂质体在血中几乎检测不到药物。1.4 CyA脂质体气雾剂呼吸系统给药Waldrep等15-16以不同卵磷脂制备了CyA脂质体气雾剂，装入特制喷雾装置内，按空气动力学要求，使喷出雾化液体的粒径控制在最理想范围内(1-3m)，用于正常小鼠肺部和小鼠发炎肺组织。结果：载体材料在正常肺内存留时间比CyA的半衰期长16.9倍，在发炎肺组织中长7.5倍，证明脂质体气雾剂能有效的用于CyA的呼吸系统给药。1.5 CyA脂质体眼部给药Milani17等研究了CyA脂质体在眼角膜局部给药方面的应用，把含有CyA 0.21mg/ml的脂质体混悬液对眼角膜移植后的大鼠局部给药，每日给药5次，60天后移植存活率为77%，而CyA普通油剂仅为45%，大幅度的提高了大鼠眼角膜的移植存活率。然而CyA脂质体在眼角膜部位的滞留半衰期较短，造成了频繁给药，并且稳定性有待提高。2. CyA微乳剂微乳剂(microemulsion)是含油及表面活性剂的液体制剂,可增加亲脂性药物和难溶性药物的溶解度和溶出性能，从而改善其体内吸收，提高口服生物利用度。CyA是一个含有11个氨基酸的环状多肽,具有强亲脂性，极微溶于水，其口服生物利用度仅30%，且个体差异大，将CyA制成微乳剂有望提高其生物利用度。Kovarik等18-19以CyA口服液(山地明，sandimmune)为对照品，对CyA微乳剂新山地明(sandimmune neoral)健康志愿者及肾移植患者体内药动学进行了研究。健康志愿者一次口服新山地明或山地明后，其血浆药动学研究显示：微乳剂相对生物利用度为174%-239%，与山地明相比，微乳中CyA的吸收速率和生物利用度提高，不同受试者血浆峰浓度、达峰时间、AUC及t1/2等药动学参数的差异却明显减小。肾移植患者口服微乳剂和服用山地明相比，在治疗剂量范围内，AUC平均增加了30%，在药物浓度时间曲线上，2次给药间隔期间的曲线更平缓。以上说明，微乳剂提高了CyA的口服生物利用度，使健康人和肾移植患者体内CyA药动学参数的变异性减小，缩小了个体差异。叶国庆等20自制了CyA微乳剂,颜色及澄明度均符合中国药典规定，制剂稳定，以市售新山地明作对照，对其大鼠体内药动学及相对生物利用度进行研究，二者药动学均符合二室模型，主要药动学参数Cmax、Tmax、t1/2、AUC均无显著差异，两制剂具生物等效性。3CyA微球微球是20世纪70年代发展起的新型给药系统，具有缓慢释放延长药效；提高药物稳定性，如防止药物氧化、降解，保护肽类和蛋白类药物避免酶的破坏；降低胃肠道毒副作用等特点。Eun-Jin Lee21等应用喷雾干燥技术制备了CyA-月桂硫酸钠-糊精微球，处方中CyA/月桂硫酸钠/糊精为1/3/1。以山地明做对照，犬口服给药后，微球与山地明主要药动学参数Cmax、Tmax、t1/2、AUC均无显著差异，结论：月桂硫酸钠-糊精微球能够应用于环孢素A等大分子蛋白质类药物的口服给药。4CyA纳米粒纳米粒子(Nanoparticles)是直径在10500nm之间的固状胶态粒子，活性组分(药物、生物活性材料等)通过溶解、包裹作用位于粒子内部，或者通过吸附、附着作用位于粒子表面。制备纳米粒的载体材料都是高分子化合物，以合成的可生物降解的聚合物体系和天然的大分子体系为主，前者如聚氰基丙烯酸烷基酯、聚乳酸-聚乙醇酸共聚物等等，它们在体内通过碳链的水解作用而降解，降解产物对人物基本无毒性；后者如天然的蛋白、明胶、多糖等。制备纳米粒常用的的方法有: 乳化聚合法，聚合物分散法，自动乳化溶剂扩散法，熔化乳匀法等。纳米粒中药物的释放机理可以是药物通过囊壁沥滤、渗透和扩散出来；也可以是基质本身的溶蚀而使其中的药物释放出来。由于纳米粒控释系统特有的性质，使其在药物输送方面具有许多优越性：（1）可缓释药物，从而延长药物作用时间；（2）可达到靶向输送的目的；（3）可在保证药物作用的前体下，减少给药剂量，从而减轻或避免毒副反应；可提高药物的稳定性，有利于储存；（4）可提高药物的稳定性，有利于储存；（5）可保护核苷酸，防止其被核酸酶降解；（6）可帮助核苷酸转染细胞，并起到定位作用；（7）可用以建立一些新的给药途径。这都是其他输送体系所无法比拟的。所以，纳米粒载药是一非常有前途的给药系统，对其研究会越来越深入，其用途也会越来越广泛。基于此，国内外学者研究了多种载体材料包载免役抑制药物CyA制备纳米粒给药系统，以期提高其生物利用度，降低副作用。主要包括：生物可降解聚酯类纳米粒、正电荷壳聚糖纳米粒、pH敏感性肠溶纳米粒、固体类脂纳米粒等。4.1 生物可降解聚酯类纳米粒聚酯类是目前研究较多，应用较广的生物降解的合成高分子，它们基本上都是羟基酸或其内酯的聚合物，常用的有聚乳酸(PLA)、聚丙交酯、聚己内酯(PCL)、聚乙醇酸(PGA)、聚羟丁酸(PHB)、聚羟戊酸(PVAC)、聚癸酸(PDA)等。另外，还有PLA和PGA的共聚物PLGA、PHB与PHV的共聚物PHBV、聚氰基丙烯酸异己酯(PIHCA)、聚丙交酯乙交酯(PLCG)等。此类化合物具有生物可降解性,对组织刺激作用很少，是一种优良的，生物可降解的聚合物。Italia22等采用乳化溶剂扩散技术制备了CyA-乳酸-羟乙酸共聚物poly(lactide-co-glycolide) (PLGA)纳米粒，粒径143.38.7 nm，包封率71.91.7%；体外释放实验中，药物几乎以恒量持续释放23天，并且显示很好的血浆相容性；以市售的新山地明做对照，大鼠口服灌胃后，纳米粒能够控制释放药物超过5天，高于新山地明的3天；此外大鼠口服给药后，纳米粒组大鼠血浆和肾脏中的血液尿素氮、血浆肌酐以及丙二醛水平明显低于新山地明组，说明该制剂的肾毒性要低于市售的新山地明。Sanchez23等制备的不同粒径的CyA-PLGA纳米球和微球,粒径0.2-30m，药物以分子形式分散在PLGA基质中，药物释放呈双相动力学规律，药物释出速度及释放持续时间可通过改变粒径大小和PLGA的分子量而改变。以市售CyA溶液作对照进行小鼠皮注，对照组血药峰浓度在用药后8h出现，第4天已测不到CyA的存在；与对照组相比，纳米球及1m的微球血药峰浓度更高，并能保持较高血药浓度达2周。黎洪珊24等用PLA包封CyA制备的纳米囊和纳米球，粒径分别为58.5及81.7nm，包封率大于97%，含药量超过19%。以市售新山地明微乳作参比制剂，大鼠灌胃后相对生物利用度分别为112.39%和100.35%，二者峰浓度较小，分布和清除较慢。以上纳米粒的静脉注射液与市售环孢素A注射液相比，大鼠体内分布容积增大，K21减小。王学清25等采用溶剂-非溶剂法制备CyA-PLA纳米粒，电镜下粒子均匀圆整，粒径为57.5nm，以新山地明做对照研究大鼠口服药代动力学，结果显示PLA纳米粒胶体的Ka，K10和Cmax均小于新山地明(P0.05)，亦小于新山地明(P0.01)，Tmax大于新山地明(P0.05)，说明该制剂制剂比新山地明吸收缓慢，消除缓慢，具有一定的长效作用。Molpeceres26等采用水中沉淀法制备了CyA-PCL纳米粒，证实该纳米粒能够提高环孢素A的口服吸收；Carmen Varela27等人在此基础上研究了该纳米粒的肾毒性及免疫活性，发现与空白对照组对比，纳米粒组与新山地明的血浆肌酐水平均没有变化，而肾小球双氧水水平均高于空白组；体外淋巴细胞增殖实验表明，CyA-PCL纳米粒更容易被淋巴细胞摄取，说明与新山地明相比，纳米粒具有在提高免疫抑制作用的同时，并没有增大药物的副作用。Calvo28等制备了CyA-聚己酸丙酯纳米囊用于眼部给药，纳米囊有一个油性微滴内核,包裹多孔海绵状外层平均粒径210-270nm，载药量高达50%。纳米囊的特殊结构和高载药量，使CyA在兔角膜中的浓度比CyA溶液高5倍，维持时间延长3d以上，AUC比溶液明显增加说明纳米囊作为眼部给药载体，能明显提高CyA的角膜穿透能力，提高其生物利用度。CyA-聚己酸内酯纳米粒可用溶媒置换法制备，聚合物和表面活性剂的用量及制备所用注射器直径对药物包封率有明显影响，而微粒大小可通过改变制备过程中所用注射器的规格及注入速度，聚合物的浓度进行控制。聚氰基丙烯酸异己酯(polyisohexylcyanoacrylate, PIHCA)为生物降解交联聚酯，以其为载体制成的CyA的PIHCA纳米囊，不仅可提高环孢素A的眼部穿透性，使角膜，巩膜，视网膜等处药物浓度长时间保持在有效治疗浓度以上提高CyA眼部用药的生物利用度，而且可以用于CyA的口服给药和静脉给药29-30 CyA的PIHCA纳米囊小鼠口服后与乳剂相比，不但生物利用度提高，血浆清除速率减慢，而且减少了网状内皮组织对药物的摄取，使纳米囊的靶部位不再局限于网状内皮系统，从而扩展了靶向给药的范围。另外，纳米囊还使肾脏药物浓度降低，从而降低了CyA的肾毒性，由于制备工艺的不同，同样以PIHCA为载体材料制备的纳米囊和纳米球，小鼠静注后体内行为却不相同：纳米球很明显地被肝脏吸收，CyA的浓度5min达峰值，而后药物逐渐释放；纳米囊则肝脏聚集较少，而在血中缓释作用明显，证明纳米囊更适合于制成减少肝脏药量的长效靶向制剂。4.2正电荷壳聚糖纳米粒壳聚糖是由甲壳素脱乙酰制得的一种天然聚阳离子多糖，可溶于酸或酸性水溶液，无毒，无抗原，在体内能被葡萄糖苷酶或溶菌酶等降解，具有优良的生物降解性和成囊成球性。El-Shabouri31等采用乳化溶剂扩散法制备了CyA-壳聚糖纳米粒，粒径分布范围是104-148nm，Zeta电位+31.2ve，以新山地明做对照，犬给药后AUC0-24为新山地明的1.8倍，相对生物利用度提高173%，作者认为表面电荷（+）以及壳聚糖的内在促渗作用是壳聚糖纳米粒提高CyA口服吸收的关键因素。Angela32等运用离子交联技术制备了CyA-壳聚糖纳米粒，用来眼外部给药，制备的纳米粒粒径为293nm，包封率为73%，兔子眼外部给药后，48小时内在睫状体，眼房水等眼内组织以及血浆中几乎检测不到环孢素A的存在，说明该制剂能够达到眼外部局部给药的效果，提高眼外部给药的治疗指数。4.3 pH敏感性肠溶纳米粒pH敏感性纳米载体是指在体内某个特定的酸碱环境下，载体材料的性能发生改变，使释药增加的一类给药系统。利用这一特性，可以实现体内对病灶组织的靶向给药。目前pH敏感性纳米粒比较多的被用于口服给药的研究，利用肠胃道的pH的不同，采用不同的pH敏感性的高分子材料制备纳米粒，可将药物输送到肠胃道的特定部位。常用于制备pH敏感性纳米粒的肠溶材料主要有：醋酸纤维素酞酸酯、羟丙甲纤维素酞酸酯、醋酸纤维素琥珀酸酯、肠溶性丙烯酸酯、聚醋酸乙烯二甲酯、偏苯三酸醋酸纤维素等。王学清33等以溶剂非溶剂法制备了CyA-HPMCP(两种型号HP50与HP55)纳米粒，并与新山地明(Neoral)进行大鼠相对生物利用度与药物动力学行为的比较。结果3种制剂的血药浓度-时间数据均以2室模型拟合最佳，与Neoral相比，CyA-HP50NP与CyA-HP55NP的相对生物利用度分别为82.3%和119.6%，均无显著性差异；CyA-HP50NP与CyA-HP55NP的K10均较小(P0.05)，说明药物消除较慢，与CyA-HP50NP相比，CyA-HP55NP的相对生物利用度为145.3%，有显著性差异(P0.01)。分析原因可能有以下两个方面：一是两种载体的亲脂性不同与HP50相比，HP55有较高的亲脂性，胃肠道黏膜是一种类脂膜，所以可以推断HP55NP对胃肠壁的亲和性强于HP50NP，故经胃肠壁细胞吸收的机会增加，另一个原因是两种型号的载体溶解pH不同，在胃肠道pH值逐渐升高环境下，由于HP50在pH较低的小肠上段便大部分溶解，药物释放出来但此部位可能不是CyA的主要吸收部位，所以药物未来得及吸收就发生聚集，分散度下降，导致吸收缓慢，而HP55NP在较高pH条件下释放出药物，此部位可能是CyA的主要吸收部位，所以释放出来后立即被吸