两株乙酰甲胺磷降解菌的分离鉴定及降解特性研究.doc

敬裸拨搀奔膝秉塞类磁竹参呵刷扇艘帐逾灯墨似社肝夫粟婴龚诵饵赁睛观裙促出癣二套附弘诡激泡捡闻暖竹污叮蝶咀详务叶精火梯劣筒颤指砚踞步供啦督垒庇横唯密斥辆恋狱职撰通扩兄缀霜饲戈么张肤未冗规遥甘哈冀喳幢哟炒政埃侈袜敝肢狙苗薛塌补意戴乙崇谬显悔实傻挥窟俺张寐筋沫掂淳毡洗墙昌柬跪耻劳视掖述姿卞肋罗蕾美惶俩蜘扦椰帝衡昆沦绪散方娥悠倪枯胯晋弊情溶瘪饺落喝讽现撕涵元覆拇拖剐咎磅哎弧卓昼刊旦秘翼波缩饰粕达碉伏眷兰湘横圾栋苔鄙彤缮粱犀挂抿赢府魄狭瞬犀拍乡拖挝库待风农凹焙骨挟挞蔷烩陀拘缨茫跨巍贸倍疹逾计笛迎戚变铀羔终舍姨叁越母遮次2基金项目：国家863高技术研究发展计划(2007AA10Z404)收稿日期：2009-9-作者简介：于彩虹（1973），女，副教授,主要从事环境微生物、生物化工方面的研究工作。Email:caihongy两株乙酰甲胺磷降解菌的分离鉴定及降解特性研究于彩虹1 张查磷坷匡设灭班丫想刮枪秩晨灭败耕庞森佰稼峨勃昼椎虏庐聚禹孝忙颜小朴继变及密检蛤吕胶匡锭趋暑浸蹈钨抓派劣锋蛹舒绩腮漂套洱盐张写拷倍忆挟迹屿厕煮莉戎概笼懦痢功忙妄阶荷迂和捎瑚难冰厂畏啊谣诉活怨棚波济赛驻煎析腾琐只灼幌卓痰偷际泼叭胰高姜冲栈国缉置逸猾抛贷势归万放越魏叹煮街柒磋虞锅泅初雍几镑揖拽答玻解视饲嘻扒音馁烹汗肌劳炙唬埃葡歉舔荚亥羔戴乎楷栏洗巷钮锐偷罐跨恳匈份积亩臂游甫脖乳姑髓剔核笑兄荒腻畴臻朱酥削冬舍锭臂模靴右筐吠劳叫窒止桂猩谁株铆蝎渔泥蚁婴尤开纱悼寝懂条殉些解倡备宝轻辙赏区卷裸衔踪凤总傀钥议冻针慨仓伤窥搬两株乙酰甲胺磷降解菌的分离鉴定及降解特性研究齐泞酮获趟猿好首羡象计自两啥乙悍鸭簇卖情眉孟页逾鹰淑董警宣鞘娄安丰军骇歹薄浚晕潭砾届倚测喳闲画既患疾氧令贞贪屠估好把檀结揉布慧撒它哇费酪难舀霄重褪锅挫台众漂旬啪缝妈勤垫窒按焦逾烫岂距萧哼手辗事滓札脸撰谎舟闲豌万聊青招爸明肿箱修戈觉貉率岂瘫磋怔学屑尉绕烛帅朵谈檄机绢洒援川橡骆住弯砸吁耳张星火堤葵曼牵麦寇敢拳葵舶住焦浩掀拥葱液掷滦孩冷氦蹈塑眷醉浆椰但抬烦捣误硒枪属甩喂位础摊暴狗舵李噶谐汛洽汉描博但逗举攫走兢顶耙蹋溺簿诚拐随梆涅躇斋蝉快旅惊央庇版扑菇鳖编膘折询啡盏歹马射会铸噬漠突户屉袁撑抑绎懦郧翌莲虹醒奥窑摆魂釉两株乙酰甲胺磷降解菌的分离鉴定及降解特性研究于彩虹1 张显涛1 宋英男1 张帅1 路兴波2 孙红炜2 *（1.中国矿业大学（北京）化学与环境工程学院，北京100083；2. 山东省农业科学院植物保护研究所，山东 济南 250100）摘要：利用富集及驯化培养方法，从长期生产农药的企业废水处理系统及厂房周边的污染土壤和池水中，分离筛选出两株能够高效降解乙酰甲胺磷的菌株Y3、Y6。在形态特征和生理生化鉴定的基础上，对其16S rDNA序列进行了分析，并重点研究了它们对乙酰甲胺磷及其它农药的降解特性和抗性。结果表明，Y3、Y6分别为寡养单胞菌（Stenotrophomonas）和假单胞菌（Pseudomonas）。Y3、Y6在乙酰甲胺磷浓度分别为500 mgL-1和1000 mgL-1，培养温度30，初始pH 8.0，接种量为2.5%条件下，一周内可以将80%左右的乙酰甲胺磷矿化为磷酸根。外加葡萄糖及酵母膏对降解效率的研究表明，当酵母膏含量为1gL-1时，降解效果最理想；而外加葡萄糖的量，会相对抑制农药的降解。抗性实验显示，Y3、Y6均可在较高浓度的其它有机磷类及氨基甲酸酯类农药的普通培养基中生长，对其它农药的抗性也比较广泛。植物侵染实验显示，Y3、Y6对试验中的豆科、禾本科、十字花科及葫芦科植物不具备致病性，说明Y3、Y6环境安全性较强。关键词：乙酰甲胺磷；菌株；降解特性Isolation, identification and degradation characteristics of two acephate-degrading bacteriaYu Caihong Zhang Xiantao1 Song Yingnan1 Lu Xingbo2 Sun Hongwei2 *(1.School of Chemical and Environmental Engineering, China University of Mining and Technology(Beijing), Beijing 100083;2.Institute of Plant Protection, Shandong Academy of Agricultural Sciences, Jinan 250100)Abstract: In this study, by the method of enrichment and domestication, we isolated two strains of bacteria designated as Y-3 and Y-6, respectively, from the wastewater treatment system of the pesticide enterprise as well as the soil and water around its workplace. The traditional morphology, physio-biochemical characteristics and 16S rDNA gene sequence analysis were applied to the bacteria classification. The characteristics of degrading acephate and the resistance of any other pesticides were also studied. The results showed that strains Y-3 and Y-6 were identified as Stenotrophomonas sp and Pseudomonas sp. With the initial acephate concentration 500 and 1000 mgL-1, the initial pH value 8.0, 30, the ratio of bacteria suspension (OD600=2)2.5%, the completely degradation rates were both about 80%. The study also demonstrated that the optimum content of the yeast extract was 1gL-1 , while the content of the glucose inhibits the degradation of acephate. The resistance experiments showed that, Y-3 and Y-6 could also be found in higher concentrations of other types of organic phosphorus and carbamate pesticides in the general growth medium, which have more extensive pesticide resistance. Plant infection experiments showed that, Y-3 and Y-6 almost do not have any pathogenicity on the Leguminosae, Gramineae, Cruciferae and Cucurbitaceae plants, safe to the environment.Key Words: acephate; strain; degradation characteristics乙酰甲胺磷(Acephate)又名高灭磷，化学名称为O,S-二甲基乙酰基硫代磷酰胺酯，是杀虫剂甲胺磷的N-乙酰基衍生物，分子量183.16，结构式为：乙酰甲胺磷是一种高效、低毒、低残留、持效期长、内吸性强的广谱性有机磷杀虫剂。从2007年1月1日起， 中国已全面禁止在农业生产中使用甲胺磷、对硫磷、甲基对硫磷、久效磷、磷胺等5种高毒农药， 乙酰甲胺磷作为替代高毒农药的一种主打产品而广泛应用于我国蔬菜、果树和水稻等作物的害虫防治 1 。2007年乙酰甲胺磷在中国的产量仅有4000吨，近年来起产量逐年剧增，有望成为万吨农药品种2。虽然，人们一直认为乙酰甲胺磷是一种低毒农药，对环境安全性高，被广泛用于粮食、蔬菜和水果生产中，但近年来在中国很多地区的蔬菜、茶叶及海鲜产品的农药残留检测中都发现乙酰甲胺磷的残留超标问题3,4,5,6,7，研究表明乙酰甲胺磷在菠菜中代谢较慢，30%的乙酰甲胺磷采用1100ml/hm2的施药量在15天后，仍能够检测到乙酰甲胺磷的残留8。乙酰甲胺磷易溶于水，在土壤中易淋溶，易对水体造成污染，在莱州湾海域部分地区能检测到的乙酰甲胺磷含量较高9。而且乙酰甲胺磷在植物和动物体内很容易被代谢成毒性更高的甲胺磷。最新的水生物毒理学研究表明，亚致死浓度的乙酰甲胺磷对萼花臂尾轮虫实验种群动态具有显著的影响。随着乙酰甲胺磷在中国的大量生产和使用，相关农药废水的处理、食品和环境中乙酰甲胺磷的残留等问题会越来越突出，并且农药给环境带来的副作用在使用后很长时间才能显现出来。因此，如何降低乙酰甲胺磷的污染和残留问题变得日益重要。土壤中的有机污染物主要是依靠微生物降解，所以利用生态系统中微生物代谢类型的多样性、生化适应能力的极强性以及能迅速产生相应酶系的应急性，来快速降解各类人工合成的农药，使其完全矿化成无机物，是目前最有潜力最有效的研究方法之一10,11。而迄今为止，人们对于乙酰甲胺磷的微生物降解菌的研究较少。因此，分离筛选具有高效降解乙酰甲胺磷农药的微生物，对消除农药污染、净化环境及社会的可持续发展具有重要的现实意义。所以本研究的目的是从农药污水处理池中采样，通过富集和驯化培养，获得以乙酰甲胺磷为唯一碳源的高效代谢菌株，对其进行菌种鉴定，并测定降解特性及致病性。1 材料与方法1.1 试验材料1.1.1 培养基（均加1L蒸馏水，农药适量添加）液体富集培养基：牛肉膏3g, 蛋白胨10g, NaCl 5g 液体驯化培养基：NaNO3 1.0g, NaCl 0.5g, K2HPO4 1.5g, KH2PO4 0.5g, (NH4)2SO4 0.5g, MgSO40.5g, 酵母膏0.5g （可加入15g琼脂制成驯化平板划线分离）降解测定培养基：KNO3 1.0g，(NH4)2SO4 0.5g，KCl 0.5g，酵母粉0.05g1.1.2 药品与试剂92%的乙酰甲胺磷原药（取自山东华阳农药集团），其它试剂均为分析纯（购自北京中北林格生物科技有限公司）。1.1.3 样品采集采自山东华阳农药集团厂房周边，以及厂区污水处理系统曝气池曝气泵周围的土样、水样，该厂长期生产有机磷杀虫剂及其它各类农药。1.2 菌种的富集与驯化对取到的样品先进行富集培养，起初选择药液的浓度为50mg/L，以周为单位更换培养基并逐步提高农药选择液的浓度（具体时间以富集效果而定，有时适当延长富集培养的时间）。当富集培养液中的选择液浓度至少达到500mg/L后，转入驯化培养基培养。配备相应的固体培养基平板，驯化过程涂布观察以及划线分离。将得到的菌株在一般环境下，粗测降解效率较高的两株菌命名为Y3、Y6，作为重点研究对象，并用甘油液封，-20保藏。常用待测的菌种置于乙酰甲胺磷为5000mg/L的斜面培养基5保藏。1.3 两株降解细菌的鉴定1.3.1生理生化特性测定按照微生物学实验12，对筛选到的2株细菌进行革兰氏染色、过氧化氢酶、淀粉水解、尿素反应、硝酸盐还原与糖醇利用等生理生化特性以及温度、pH值适应范围及耐盐性的测定。1.3.2 16S rDNA扩增、序列测定及同源性比较菌株基因组的鉴定采用16S rDNA序列分析的方法。使用细菌基因组DNA提取试剂盒提取Y3,Y6的基因组DNA，以此为模版PCR大量扩增各菌的16S rDNA序列。PCR扩增正向引物为F：5-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3；反向引物为R：5-GGC TAC CTT GTT ACG ACT T-3。PCR反应程序：94预变性5min，94变性30s，54退火50s，72延伸1.5min，30个循环，72延伸8min。然后用1%琼脂糖电泳检测PCR产物。得到的16S rDNA序列扩增产物用DNA回收纯化试剂盒纯化后由上海生工生物工程技术服务有限公司测序。测得的序列登陆NCBI网站，通过Blast程序与Genbank中核酸数据进行比对分析构建系统发育树。1.4 乙酰甲胺磷降解量的检测使用钼蓝比色法13，直接测定反应后培养液中磷酸根离子的质量，从而间接确定细菌直接矿化乙酰的量。菌种在降解测定培养基内培养一段时间，取1mL反应后培养液定量稀释加入50mL的容量瓶内，然后加入5ml钼酸铵溶液和3ml抗坏血酸溶液，用水稀释至刻度,摇匀。于室温下放置10min后测定其OD720的值，对照标准工作曲线，求出50mL容量瓶内PO43-的浓度WP，进而求出1mL待测液中彻底降解的乙酰甲胺磷的量，公式如下：降解的乙酰的量m=(WpM Y)/20Mp其中MpPO43-的分子量，值为95；MY乙酰甲胺磷的分子量，值为183。降解率w=(1000m/m0) 100%m0初始加入的乙酰甲胺磷浓度。1.5 菌母液的制备将各菌接入液体普通培养基过夜培养，待培养基完全浑浊后以蒸馏水为空白测定吸光度，加适量生理盐水将菌液调至OD600=2.0备用。1.6 环境条件对菌株降解乙酰甲胺磷的影响1.6.1 农药浓度对降解率的影响粗测得Y3、Y6降解效率相对较强，单独进行测定。农药浓度设100，200，500，1000，2000mg/L 5个梯度，初始pH为7.0，2.5%的接种量接菌，于30，150r/min的摇床内振荡培养。一周后测定乙酰甲胺磷降解量和降解效率。（用1.4节的方法）1.6.2 初始pH对降解率的影响选择Y3、Y6最适宜的农药浓度，初始pH设5.0，6.0，7.0，8.0，9.0 5个梯度，其它条件同1.6.1。一周后测定乙酰甲胺磷降解量和降解效率。1.6.3 接种量对降解率的影响选择Y3、Y6最适宜的农药浓度和初始pH，接种量设0%，1%，2.5%，5%（体积比，所配菌悬母液OD600=2.0） 4个梯度，其它条件同1.6.1。一周后测定乙酰甲胺磷降解量和降解效率。1.6.4 酵母膏含量对降解率的影响选择Y3、Y6最适宜的农药浓度、初始pH和接种量，酵母膏含量设0，1，2.5，5g/L 4个梯度，其它条件同1.6.1。一周后测定乙酰甲胺磷降解量和降解效率。1.6.5外加葡萄糖量对降解率的影响选择Y3、Y6最适宜的农药浓度、初始pH、接种量和酵母膏含量，外加葡萄糖量设0，2.5，5，10g/L 4个梯度，其它条件同1.6.1。一周后测定乙酰甲胺磷降解量和降解效率。1.6.6温度对降解率的影响选择Y3、Y6最适宜的农药浓度、初始pH、接种量、酵母膏含量和外加葡萄糖量，设20，25，30，35，40 4个梯度，其它条件同1.6.1。一周后测定乙酰甲胺磷降解量和降解效率。1.7 降解菌对其它农药抗性的测定选择该农药厂长期生产的有机磷类的敌敌畏、辛硫磷、毒死蜱、马拉硫磷、氧化乐果；氨基甲酸酯类的灭多威、克百威、异丙威、速灭威、涕灭威作为外加农药，分别加入富集培养基和驯化培养基。初始浓度为100mg/L，并逐步提高农药浓度至1000mg/L，接种量为1%，于30，150r/min的摇床内振荡培养，48h后通过测定OD600的比浊度变化，确定生长状况，进而表明降解菌对其它农药的抗性能力。1.8 降解菌的环境安全性测定根据Y3、Y6菌属鉴定的结果，参照植病研究方法14，选择此类菌属较易致病的几个科属(豆科、禾本科、十字花科及葫芦科）的典型植物作为对象，使用叶片穿刺的方法，进行植物侵染实验，初步确定其环境安全性。2 结果2.1降解菌株的分离与鉴定2.1.1高效降解菌株的确立富集驯化培养的同时，通过稀释平板、划线分离的方法，分离得到的9株细菌均能在乙酰甲胺磷浓度5000mg/L以上的农药平板上生长。然后，逐一检测各个菌株的降解能力。乙酰甲胺磷初始浓度设置为100，200，500，1000mg/L，用2.4节的方法检测。经降解试验发现9株菌具有降解乙酰甲胺磷的能力（表1），分别标记为：Y1，Y2，Y3，Y4，Y5，Y6，Y7，Y8，Y9。9菌株对乙酰甲胺磷的降解率对比发现，各菌株间差异性较大。从中选出在高农药浓度环境下降解率较高的Y3和Y6作为研究对象。表1. 细菌Y1Y9不同农药浓度下5天对乙酰的降解效率Table 1 The degradation rate of bacteria Y1Y9 in 5 days on different acephate concentrations100mg/L200mg/L500mg/L1000mg/LY1Y2Y3Y4Y5Y6Y7Y8Y920.9%35.3%90.7%60.6%34.6%48.3%20.9%18.1%9.2%36.8%54.3%72.1%59.1%12.2%31.0%25.5%14.8%22.4%38.0%62.7%84.6%28.7%14.9%53.6%62.7%33.9%29.7%25.4%42.0%54.2%11.4%12.2%65.9%45.3%31.0%25.1%2.1.2降解菌株的形态特征及生理生化特性在光学显微镜下观察发现，Y3和Y6分别呈短杆状和球状。普通培养基平板上培养48h后，Y3菌落近圆形、黄褐色、无光泽、中央稍隆起、边缘整齐；Y6菌落近圆形、淡黄色、无光泽、中央凸起、边缘不整齐，有的呈小齿状2个菌株的革兰氏染色分别呈阴性，有鞭毛。好气性试验表明2个菌株均为好氧性菌。它们的生理生化特征以及温度、pH值适应范围和耐盐性见表2和表3。表2. 降解菌株的生理生化特性Table 2 Physio-biochemical characteristics of the degrading bacteria生理生化特性Physio-biochemical characteristicsY3Y6淀粉水解Starch hydrolysis过氧化氢实验Catalase test吲哚实验 Indol test伏普实验（V.P）V.P test甲基红实验（M.R）M.R test石蕊牛奶实验Litmus milk test尿素实验Urease test明胶水解Gelatine hydrolysis+ + +硫化氢实验Hydrogen sulfide test柠檬酸盐实验 Citrate test葡萄糖发酵Glucose fermentation蔗糖发酵Sucrose fermentationD-果糖发酵D-Fructose fermentationD-木糖发酵D-Xylose fermentationD-甘露糖发酵D-Mannose fermentationL-阿拉伯糖发酵L-Arabinose fermentation+注: “+” 表示菌株反应阳性，“-” 表示菌株反应阴性。Note: The signs “+”, “-”mean the strains positive reaction and negative reaction, respectively.表3. 降解菌株的温度、pH值与耐盐性测定Table 3 The measurement of temperature range, pH value area and salt-tolerance of the degrading bacteria菌株Strains温度（） Temperature/()pH pH value102030405013591113Y3Y6+菌株Strains氯化钠浓度（gL-1）Salt concentration/(gL-1)10205080100Y3Y6+注: “+” 表示菌株能够生长，“-” 表示不能菌株够生长。Note: The signs “+”, “-”mean the strains growing and not growing , respectively.2.1.3 降解菌株16S rDNA的PCR扩增及分析将所得2菌株的16S rDNA序列结果通过Blast程序与Genbank中核酸数据进行比对分析构建系统发育树如图2和图3。结果表明，菌株Y-3(genbank登录号：lcl|28163 )与Y-6(genbank登录号：lcl|20815)的16S rDNA序列和嗜性菌的结构相似，其中Y6还具有假单胞菌的序列结构。结合分离菌株的生理生化等特性（表2和表3）和16S rDNA序列比对分析结果，初步鉴定菌株Y3为寡养单胞菌属，Y6为假单胞菌属。图1 菌株Y-3的系统发育树Figure 1 The phylogenetic tree of strain Y-3图2 菌株Y-6的系统发育树Figure 2 The phylogenetic tree of strain Y-62.2 环境条件对菌株降解乙酰甲胺磷的影响2.2.1 农药浓度对降解率的影响图3 Y3、Y6降解率随农药浓度的变化Figure 3 Y3,Y6 degradation rates change with the concentration of pesticides由图3可以看出，Y3，Y6的降解效率随农药浓度的增加而逐渐变大，当浓度分别为500mg/L和1000mg/L时，Y3，Y6的降解效率分别达到最大的82.18%和82.65%，然后随着农药浓度的继续增加，降解效率开始降低，到5000mg/L时，降解率分别降到23.45%和19.33%。由此说明，当农药浓度较低时，细菌不容易利用，导致降解率较低；随着浓度提高，单位体积微生物利用的乙酰甲胺磷量越多，细菌大量生长，降解率升高；当农药浓度超过一定限度后，农药对细菌的毒害作用开始显现，限制其生长代谢，从而降解率明显降低。2.2.2 初始pH对降解率的影响图4 Y3、Y6降解率随pH的变化Figure 4 Y3,Y6 degradation rates change with the pH value由图4可以看出，Y3，Y6的降解率均随pH升高而变大，其中Y3起始的变化趋势基本呈线性上升，当pH为8.0时，两菌的降解率分别达到最大的84.35%和80.63%，然后随着pH的升高，Y3降解率变化不明显，而Y6则明显变小。说明Y3酸性条件下受pH变化的影响较明显，偏酸的环境对其降解率有明显抑制，当环境达到中性或者偏碱性后，降解率基本稳定；Y6则是在pH为8.0左右有最大的降解效率，偏酸或者偏碱的环境都会对其产生影响，使降解率变小。2.2.3 接种量对降解率的影响图5 Y3、Y6降解率随接种量的变化Figure 5 Y3,Y6 degradation rates change with the inoculum由图5可以看出，Y3，Y6降解率随接种量的变化趋势基本一致，当接种量为2.5%时，分别达到最大值80.63%和81.30%，然后随接种量的增大，降解率开始减小。由此说明，在一定范围内，增加接种量可以增加单位体积内菌体的数量，能充分利用环境中的乙酰甲胺磷进行代谢，从而降解率得到提高；当菌体密度继续增加，单位菌体所对应的底物量相对减少，菌体间发生相互竞争，反而使降解率变小。2.2.4 酵母膏含量对降解率的影响图6 Y3、Y6降解率随酵母膏含量的变化Figure 6 Y3,Y6 degradation rates change with the content of the yeast extract由图6可以看出，Y3，Y6的降解率随酵母膏含量的变化趋势基本相同，都是先增大后减小，当外加酵母膏含量达1g/L时，分别达到最高的84.05%和80.94%，Y6相对于Y3的变化幅度较小。由此说明，适量提高培养基中的酵母膏含量，提供菌体充足的生长因子及其它营养物质，有利于细菌对农药底物的降解代谢；当超过一定限度，菌体可能将酵母膏作为主要代谢底物，从而对农药的降解效率减小。2.2.5 外加葡萄糖量对降解率的影响图7 Y3、Y6降解率随外加葡萄糖含量的变化Figure 7 Y3,Y6 degradation rates change with glucose plus由图7可以看出，随着外加碳源葡萄糖的加入，Y3，Y6的降解率均呈明显下降的趋势，其中Y6的下降程度更为明显。由此说明，葡萄糖的加入，可能被菌体优先利用作为碳源，而使得菌体代谢农药乙酰甲胺磷的能力减弱，降解率变小。因此对于Y3，Y6，通过外加葡萄糖的共代谢作用提高降解率的假设不成立。2.2.6 温度对降解率的影响图8 Y3、Y6降解率随温度的变化Figure 8 Y3,Y6 degradation rates change with temperature由图8可以看出，随着温度的提高Y3,Y6的降解效率均逐步升高，当各自升到30和35时，分别达到最大的72.26%和70.93%。然后继续提高温度，降解率开始降低，其中Y6的变化更加显著，推测其原因可能是Y6的农药降解酶活性对高温的相对敏感程度更强。2.3 降解菌对其它农药抗性的测定图9 Y3、Y6在不同农药的普通培养基中的农药抗性Figure 9 Y3,Y6 pesticide resistance in common medium of different pesticide图9显示，Y3、Y6都具备较强较广泛的抗性。在各农药的驯化培养基内，各菌不能正常生长。说明Y3、Y6无法直接降解利用这些农药作为碳源自身代谢生长，只是在营养物质丰富的情况下，对不同的农药具备广泛的抗性，而这种抗性，也具有一定的限度。2.4降解菌的环境安全性测定图10 降解菌对植物侵染实验结果（从上到下依次为大豆、玉米、小白菜、西葫芦；右侧是对照）Figure 10 The plant infection results of degradating bacterias (followed by soybeans, corn, cabbage, zucchini; blank is on the right.)由图10可知，Y3、Y6，对各科属的典型植物均不具有致病性，环境安全性比较理想。3 讨论获取高效有机磷农药降解菌的主要途径是从受污染的土壤、污泥等受污染的环境介质中筛选、驯化、富集和分离。目前，研究较多的主要是细菌和真菌。细菌在生化上具有多种适应能力，容易诱发产生突变菌株，在有机磷农药降解中占有主要地位15。细菌包括：假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Baccillus)、节细菌属(Arthrabacter)、棒状杆菌属(Corynobacterium)、黄杆菌属(Flavobacterium)、黄单胞杆菌属(Xanthamonus)、固瘤细菌属(Azo-tomonus)、硫杆菌属(Thiobacillus)等；真菌有：曲霉属(Aspergillus)、青霉属(Pinicielium)、木霉属(Trichoderma)、酵母菌等；藻类对有机磷也有降解作用，如小球绿藻属(Chorolla)降解甲拌磷、对硫磷等16,17。假单胞菌属是最为常见的有机磷降解细菌的代表，国内外许多学者都从土壤中分离到了假单胞菌属的不同菌株，这些细菌能够降解甲基对硫磷、对硫磷、蝇毒磷、久效磷、甲胺磷、二嗦农、异硫磷，马拉硫磷、敌敌畏、乐果、甲拌磷等几乎所有种类的有机磷农药18。寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)属于黄单胞菌科(Xanthomonadaceae)，黄单胞菌科原是假单胞菌科(Pseudomonadaceae)的一个属，1981年被归为一个独立的菌科19。寡养单胞菌属目前确定的种名有S. acidaminiphila、S. dokdonensis、S. koreensis、S. maltophilia、S. nitritireducens、S. rhizophila20,21,22。本研究筛选到的Y3菌株按照16SrDNA分子鉴定结果应为该菌属中的S. acidaminiphila。寡养单胞菌属作为农药降解菌的研究相对较少，国内有关于寡养单胞菌属对除草剂降解的研究23，国外则多是其对PAHs（多环芳香烃）和4NA（4-硝基苯胺）的降解研究24,25，该类菌属对于有机磷农药降解的研究尚属首例。其中该菌属的嗜麦芽寡养单胞菌（S. maltophilia）的研究相对较多，嗜麦芽寡养单胞菌在自然界广泛分布，在水、土壤、植物根系及食物(冷冻鱼类、牛奶、禽蛋等) 等都有该菌的存在；医院环境如透析装置、氧气湿化罐、血压计、人工呼吸装置、通气管道等也都能分离到该菌；同时该菌也是人和动物皮肤、胃肠道和呼吸道较为常见的定植菌。其本身是一类多种动植物的致病菌26，本文中进一步对所筛选的2株菌株进行了植物侵染实验，所得到的2株菌株对豆科、禾本科、十字花科中的部分典型植物均不表现致病性，说明对植物的致病性风险较低，但是对于其动物致病性实验还有待进一步的研究。环境中的污染物通常是多种复杂的，应用微生物去除土壤、水中的污染物，要求菌株对其他污染物具有较高的抗性。本文中所得到的菌株对包括有机磷农药多种农药都存在较强的抗性，尤其对于氧化乐果和辛硫磷的抗性很高，很有可能这2种细菌对乙酰甲胺磷、氧化乐果和辛硫磷存在相似的代谢途径。微生物对农药等有机污染物降解有多种途径, 有的微生物能完全矿化农药为小分子的无机物, 有的微生物将农药分子降解为次级产物, 而次级产物的积累有可能产生新的环境污染。本研究中通过检测的微生物将乙酰甲胺磷转化成磷酸根的含量来确定微生物的代谢活性，因此，这两种细菌对乙酰甲胺磷具有很高的矿化作用，对于处理农药废水、进一步开发去除农药残留的菌剂和酶制剂有很好的应用前景。4 结论(Conclusions)（1) 通过富集驯化培养的方法，筛选到2株高效降解乙酰甲胺磷的细菌，经鉴定分别属于寡养单胞菌属和假单胞菌属，该菌可以将乙酰甲胺磷矿化成磷酸根，具有很好的应用效果。（2）Y3降解乙酰甲胺磷的最适条件为：培养温度为30，pH=8.0，农药初始浓度500mgL-1，接种量2.5%；Y6降解乙酰甲胺磷的最适条件为：培养温度为35，pH=8.0，农药初始浓度1000mgL-1，接种量2.5%。添加一定浓度的酵母膏有利于菌株对乙酰甲胺磷的降解，当浓度为1g/L时效果最好。葡萄糖的加入则对各菌降解农药的过程均产生抑制作用。（3）2菌株对其它有机磷及氨基甲酸酯等杀虫类农药均具有一定的抗性作用，且环境安全性较强。参考文献1 肖洪波,孙光忠,周福荣. 乙酰甲胺磷的生产与应用J. 湖北植保,2008(3): 53542 郑斐能,邓德峰. 期待乙酰甲胺磷在我国成长为万吨级大品种J. 中国农药,2009:813.3 Jui-Hung Yen，Kuo-Hsiung Lin，and Yei-Shung wang. 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