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生物催化技术摘要：本文主要探讨生物催化剂的种类、生物催化酶的制备、表征、应用等方面。其中固定化酶有许多粗酶液没有的特点,但制备固定酶首先要经过大量复杂的分离、纯化工作,而且一种固定化酶只能用于特定的单步反应，以及对现代生物催化技术的发展及研究。关键词：生物催化剂；性质；用途；发展引言：生物催化剂是游离的或固定的细胞或酶的总称，它们在生物反应中起着催化剂的作用。生物催化是利用生物催化剂，改变（通常是加速）化学反应速率，合成有机化学品和药物制品。生物催化涉及三个学科的不同部分：化学中的生物化学和有机化学；生物学中的微生物学、分子生物学和酶学；化学工程学中的催化、传递工程和反应工程学。人类很早就知道利用酶和微生物细胞作为生物催化剂进行生物催化已有几千年历史，早已发明了麦芽制曲酿酒工艺，古埃及和古代中国都有历史记载。近现代认识酶是与发酵和消化现象联系在一起的。后来创造了“酶”这一术语以表述催化活性，近代科学技术对酶的认识研究，成为现代酶学与生物催化研究的基础。现代科学技术以及化工行业的不断发展，对于催化剂的要求越来越高，人们不断探索新的催化技术以满足不发展的化工行业的需求。与化学工业相反，生物催化技术工业是产销量不大的行业，主要应用与制药领域及少数的化工行业及视频行业。生物催化技术对化学工业的影响主要是可再生资源的生物加工。自生物技术诞生之日起，人们就一直致力于把它应用到工业生产当中去。工业生物催化技术是生物技术应用中一个新兴和关键的领域。生物催化技术首先从和它联系做紧密的医药、农业开始，逐渐涉及到化工、材料等行业，并通过它们影响社会生产、生活的各个方面。美国21实际发展规划中预计，到2020年，通过生物催化技术，将实现降低化学工业原料消耗、水资源消耗、能量消耗30%，减少污染物的排放和污染扩散以蛋白质酶的工程应用为核心的工业生物催化技术,被认为是生物技术继生物医药和转基因植物之后的第三次浪潮。它的发展与应用将对人类的工业化学过程带来根本的变革。工业生物催化的兴起与以下的两个关键技术因素有密切的关系:(1)蛋白质定向进化技术的出现,(2)基因组学和蛋白质组学的发展。探讨了工业生物催化技术的现状和发展趋势,并对我国如何发展该领域的基础和应用研究提出一些见解。1.生物催化剂的种类及性质1.1 生物催化剂的种类：从酶的作用和功能的发现过程中了解到，人们最早使用的是游离的细胞活体，即使用这些细胞中的酶作为生物催化剂；在此基础上考虑将该酶蛋白质从细胞中提取分离出来。比较纯的催化剂形态进行的反应催化，也可以采用固定化技术将酶或细胞固定在惰性固体表面后再使用。因此，固定化细胞和固定化酶又称固定化催化剂生物催化剂的类别如下：生长细胞、休止细胞、冻干细胞、处理细胞1.2 生物催化剂的性质生物催化剂具有催化高效性，催化种类的专一性及反应条件专一性三大基本性质。生物催化剂的三大特征决定了生物催化剂的广泛的用途6。2.固定化酶的制备方法:2.1传统的制备方法：2.1.1吸附法吸附法是利用物理吸附法，将酶固定在纤维素、琼脂糖等多糖类或多孔玻璃、离子交换树脂等载体上的固定方式。显著特点是：工艺简便及条件温和，包括无机、有机高分子材料，吸附过程可同时达到纯化和固定化；酶失活后可重新活化，载体也可再生。但要求载体的比表面积要求较大，有活泼的表面。2.1.2包埋法包埋固定化法是把酶固定聚合物材料的格子结构或微囊结构等多空载体中，而底物仍能渗入格子或微囊内与酶相接触。这个方法比较简便，酶分子仅仅是被包埋起来，生物活性被破坏的程度低，但此法对大分子底物不适用。(1)网格型将酶或包埋在凝胶细微网格中，制成一定形状的固定化酶，称为网格型包埋法。也称为凝胶包埋法。 (2)微囊型把酶包埋在由高分子聚合物制成的小球内，制成固定化酶。由于形成的酶小球直径一般只有几微米至几百微米，所以也称为微囊化法。2.1.3结合法酶蛋白分子上与不溶性固相支持物表面上通过离子键结合而使酶固定的方法，叫离子键结合法。其间形成化学共价键结合的固定化方法叫共价键结合法。共价键结合法结合力牢固，使用过程中不易发生酶的脱落，稳定性能好。该法的缺点是载体的活化或固定化操作比较复杂，反应条件也比较强烈，所以往往需要严格控制条件才能获得活力较高的固定化酶。 2.1.4交联法交联法是用多功能试剂进行酶蛋白之间的交联，使酶分子和多功能试剂之间形成共价键，得到三向的交联网架结构，除了酶分子之间发生交联外，还存在着一定的分子内交联。多功能试剂制备固定化酶方法可分为：(1) 单独与酶作用；( 2) 酶吸附在载体表面上再经受交联；( 3) 多功能团试剂与载体反应得到有功能团的载体，再连接酶。交联剂的种类很多，最常用的是戊二醛，其他的还有异氰酸衍生物、双偶氮二联苯胺、N，N-乙烯马来酰亚胺等。交联法的优点是酶与载体结合牢固，稳定性较高；缺点是有的方法固定化操作较复杂，进行化学修饰时易造成酶失活。2.2新型的制备方法：2.2.1共价固定法:酶分子表面存在很多可供利用的化学基团。选择性地利用酶分子表面远离活性位点的特定稀有基团(如巯基)进行反应，使该基团与载体上另一基团共价交联来同定酶蛋白，使其活性中心朝向溶液方向，以达到控制其空间取向的目的。Collioud等化学合成一个异双功能试剂(N-m一3一(trifluoromethyl)diazirin-3-ylphenyl一4一maleimidobutyr amide)，他们利用这种双功能试剂成功地实现了氨基酸、合成肽和抗体Fab片段的定向固定。Stein等通过衍生全氟叠氮基苯疏水交联共价固定一种脂链细胞蛋白，取得了一致的空间取向。固定后的蛋白质分子结合牢固、稳定性佳，不能被离子或非离子去污剂清除。2.2.2氨基酸置换法:利用基因定点突变技术在蛋白质分子表面合适位置置换一个氨基酸分子，通过该氨基酸残基特殊的侧链基团控制固定方向。Huang等通过定点突变在枯草蛋白酶(subtil2isin)分子表面远离活性中心的位置引入半胱氨酸(Cys)残基。经蛋白质空间折叠后暴露出Cys，然后利用Cys残基上的巯基固定枯草蛋白酶分子，取得了较好的固定效果，固定效率和固定后催化活性均有很大提高。2.2.3抗体耦联法:大多数抗体具有足够的稳定性承受各种活化与偶联方法。抗体分子中很多可供偶联用的官能团可以通过赖氨酸的-氨基或末端氨基、天冬氨酸的-氨基、谷氨酸的-氨基或末端羧基进行一般性的偶联。Spitznagel等用碘乙酸活化多孔玻璃珠来定向固定抗体酶 (abzyme)48G7-4A1的Fab片段，抗体酶Fab片段保持了很好的催化活性。抗体分子Fc区的糖链部分氧化可产生醛基，醛基与载体上的氨基通过缩合反应可实现定向固定。醛基若与载体上的酰肼通过腙键结合实现抗体分子的定向固定，与随机固定相比，固定后抗体稳定性提高的同时免疫吸附活性也提高了3倍。2.2.4生物素-亲和素亲合法:生物素是存在于所有活细胞内但含量甚微(00001)的中性小分子辅酶。亲和素是一个含有四个相同亚基的四聚体，每个亚基均含一个生物素结合位点(解离常数105molL) 。生物素与亲和素或相应细菌中的链霉亲和素有高专一性的、极强的亲和力。这种特性使其成为免疫分析、受体研究、免疫组织化学、基因工程和蛋白质分离等领域中独特有力的工具。2.2.5疏水定向固定法:细胞粘着分子(cell adhesion molecules，CAMs)是介导细胞-细胞、细胞-底物粘着、细胞发育和细胞信号发生的分子。细胞粘着分子和其它细胞表面分子通常通过疏水作用固定在脂质膜上，磷脂锚定是常选择的方式。接触位点A糖蛋白是调节发育的细胞粘着分子，产生于多细胞发生早期，通过形成高亲和、EDTA稳定的接触位点介导细胞粘着。接触位点A糖蛋白可通过神经酰胺疏水同定在细胞表面。疏水定向固定可保持蛋白质分子结构、生理活性及天然构象。这种通过疏水作用的固定，固定的效率高，固定为非共价，而且固定过程可逆，用去污剂可终止或消除同定应。Stein等用庚基胺修饰羧甲基葡聚糖载体表面的羧基来疏水固定接触位点A糖蛋白分子，成功地控制了固定位点的空间取向。用mAb7l特异结合来检测csA的活性状态，mAb71结合良好，而mAb353则不能结合。2.2.6微波/超声辅助固定化:微波是一种电磁波，波长为0.1100 cm。微波加热的主要原理是介质材料的极性分子在微波高频电场的作用下反复快速取向转动而摩擦生热，是从物质内部开始，瞬时达到需要的温度。微波加热具有许多传统加热不具备的优点，包括：加热迅速、均匀，不需要热传导过程，内外同时加热，加热时间短；加热质量高，营养破坏少；节能高效；易于控制功能等超声波是指振动频率大于20 kHz以上的一种纵波，在介质中传播时，使介质发生物理的和化学的变化，从而产生一系列超声效应，包括热效应、机械效应、空化效应和化学效应。研究认为，超声波对液体化学反应速度和产率的影响主要是超声波在液体介质中的空化作用，超声可使液体介质中形成微泡，其破裂伴随能量的释放，可以提高许多化学反应的速度。到目前为止，超声波技术对物质提取，高分子降解，酶解反应等都有很好的促进作用。其中超声波酶解反应具有高效、廉价、无污染，可提高酶促反应速度和有效成分的产率。3酶固定化原理经戊二醛活化的载体具了能与蛋白酶分子的自由氨基反应的基团，及-CHO。经过戊二醛活化的载体与酶蛋白分子的反应机理是戊二醛的另一个没有与为载体相连的-CHO再与酶分子的氨基反应，形成-N=C-键，从而将酶分子固定在载体上。在加入酶液前必须将过量的戊二醛试剂洗去，因为戊二醛是一种交联剂，它能与酶分子交联，使酶分子之间形成共价键，得到三维网状交联结构。此外，戊二醛是蛋白的变性剂，过量的戊二醛本身会使蛋白质分子中毒，降低酶的活性，具体反映的机理如图所示。4.生物催化酶的光谱表征：还原型辅酶（NADH）的光谱吸收曲线（吸收峰分别在260nm和340nm）生化谷丙转氨酶检验试剂的反应原理如下： -酮戊二酸 + L-丙氨酸 ALT L-谷氨酸 + 丙酮酸（初反应）丙酮酸 + NADH + H+ LDH L- 乳酸 + NAD+ （主反应）NADH的氧化速率与样本中ALT酶活力成正比，NADH在340nm处有特征吸收峰，在340nm处测其吸光度的下降速率即可计算出ALT的活性。5.固定化酶的应用5.1医药领域固定化脲酶：脲酶是专一性催化尿素水解的酶，应用于尿素生产控制、产品检验，也广泛用于临床医学、医学检验等，脲酶的固定化在血液透析中有着极佳的应用前景。固定化磷酸酯酶：磷酸酯酶的作用是催化水解低密度脂蛋白上的磷脂的酶，加速体内低密度脂蛋白的代谢。人体中的低密度脂蛋白是主要的血浆胆固醇载体，由于其在体内代谢缓慢，易形成高血浆胆固醇，以至引起心血管疾病，因此磷酸酯酶的固定化可以应用于心血管疾病的治疗。固定化葡聚糖酶：葡聚糖酶常用于水解在血液替代品的制备过程中产生的右旋糖酐。5.2食品行业:固定化酶应用于食品检测：固定化酶技术的发展使生物传感器也得到相当大的发展，它不仅使食品成分的高选择性、快速、低成本分析测定成为可能，而且生物传感器技术的持续发展将很快实现食品生产的在线质量控制，降低食品生产成本，并可以保证安全可靠及高质量的食品。5.3环境保护:在环境监测方面，固定化酶也可以用于测定有毒物质含量以进行环境监测。杨雪梅等选用硅胶、活性炭、大孔树脂，在一定条件下用物理吸附法固定蛋白酶，3种载体固定的蛋白酶对含高浓度蛋白质的淀粉黄浆废水进行水解实验，发现大孔树脂对蛋白酶的效果良好，并对含高浓度蛋白质的废水处理效果最好。在废水处理中，固定化酶也受到了越来越多科学家的关注。生活污水和工业废水中有害成分主要是氯酚，将辣根过氧化物酶大量吸附在磁石上，可以保证其100%的活力，且净化效果是粗酶的20多倍。5.4生物传感器方面的应用:在医学领域，生物传感器因快速、灵敏、专一、响应快等优点发挥着越来越重要的作用。目前，在检测多种细菌、病毒及其毒素等多个方面生物传感器已有较广泛应用。比如高精度血糖分析仪是采用固定化酶的生物传感分析仪，其分析精度可以达到0. 5% 2%，比家用保健类生物传感器几乎高一个数量级，比目前医用生化分析仪的精度也高2% 3%。这在血糖分析领域是非常重要的6。酶电极现已用于测定各种糖类、抗生素、氨基酸、有机酸、脂肪、醇类、胺类以及尿素、尿酸等。5.5能源利用:近年来不少学者为了解决能源紧缺问题致力于利用固定化的脂肪酶催化合成生物柴油。高阳等研究了利用多孔渗水物质为载体固定脂肪酶，使其可在低水环境中合成生物柴油。氢气作为一种清洁能源已引起人们的关注。有学者利用聚丙烯酰胺凝胶包埋丁酸梭状芽孢杆菌IFO3847菌株，可以利用葡萄糖生产氢气，并且稳定性好，无需隔氧6.固定化酶的研究进展固定化酶对提高酶的稳定性，拓展酶的应用领域具有非常重要的意义。目前常用固定化方法普遍存在固定化使用试剂和载体成本高，固定化过程中酶的构象受到影响及底物结合部位和活性中心受载体封闭所引起的酶活损失较大，固定化操作过程繁琐等缺点，限制了固定化酶的产业化应用。针对当前固定化酶载体和方法的不足，本文采用反相悬浮包埋法合成磁性琼脂糖微球，经环氧氯丙烷和亚氨基二乙酸处理使微球带上螯合基团，经吸附铜离子后，制备了磁性琼脂糖亚氨基二乙酸(IDA)-Cu2+金属螯合载体，利用该载体定向固定了木瓜蛋白酶，固定化最适条件为Cu2+1.510-2mol/g载体、固定化时间4h、固定化pH7.0、给酶量30mg/g载体。固定化酶的最适反应温度70、最适反应pH8.0，固定化酶的热稳定性明显高于溶液酶，固定化酶活力回收为68.4，且有较好的操作稳定性，载体重复使用5次后固定化酶酶活为首次固定化酶79.71。本文研究了利用金属螯合载体固定多酚氧化酶时，固定化酶的性质。得出固定化酶的最适反应温度为50，最适反应pH值7.0，固定化酶的酸碱耐受性明显好于溶液酶，固定化酶反复使用6次，酶活仍保留50左右，固定化载体可以反复使用5次，仍保持良好的性能。在使用金属螯合载体固定化酶时，固定化反应条件温和，对酶的高级结构影响小，酶活回收高；固定化酶的热稳定性明显提高；载体的再生、酶的固定化过程操作简单；固定化酶及载体可多次重复利用，固定化酶生产成本低。因此该技术在工业上具有广泛的应用前景。高分子微球具有一定的化学和机械稳定性,能抵抗微生物和酸碱的作用,是优良的固定化酶载体材料.针对制备高活性、高稳定性固定化酶对载体材料的性能要求,评述了高分子微球的组成和功能性基团的可设计性、粒径与形态可控性、多孔和大比表面积等结构性质,概括了载体结构性质对固定化酶催化活性的影响规律,提出了对不同性质的生物酶量体裁衣,设计制备特效的载体材料是高分子微球固定化酶研究的发展趋势.同时介绍了固定化青霉素酰化酶和固定化脂肪酶在工业催化领域的应用.首先用分相法和填充法制作了两种多孔玻璃微珠FXBL和TCBL，用它们作为载体分别用物理吸附法、共价偶联法和重氮法固定了-淀粉酶，在对它们的固定效果比较后，选取了共价偶联法进行了较详细的研究；确定了共价偶联a-淀粉酶的最佳固定条件、最佳应用条件和固定化酶的性质；并研究了多孔玻璃微珠制作条件对固定化酶的影响和多孔玻璃微珠对过氧化氢酶及谷氨酸脱羧酶的固定化效果选用丙烯酸(AA)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHM)为单体,以N,N-亚甲基双丙烯酰胺(MBAA)为交联剂,以乙醇水溶液为制孔剂条件下进行反相悬浮聚合,得到珠状共聚物载体,该载体是一种新的酶载体形式,在国内外的相关文献中均未见报道.用红外光谱对其结构进行了表征.对载体与有机胺的胺解反应进行了研究,发现共聚物载体分子链上的丙烯酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯基易于在温和条件下与胺基发生胺解反应,从而为该类载体应用于含游离胺基的生物活性物质分子的固定化提供了依据.7参考目录：1拜永孝,李彦锋，马应霞，等固定化酶技术及其应用J化学通报，2009，(68)：1-62 胡和兵,王牧野,吴勇民,等.酶的固定化技术及应用J.中国酿造,2007(7):4-7. 3工家东，姜子明，曹彬，毕韬韬，侯红萍固定化糖化酶的研究J中国调味品,2008，(3)：14164 王新广.生物技术简介J.北京水产2004.2.31 5 黄仲涛，耿建铭.工业催化M.北京.化学工业出版社. 6 李祖义，陈颖.生物催化技术在化学工业中的应用J.精细与专用化学,2003.13.3-5 7 New Biocatalysts: Essential Tools for a Sustainable 21st Century Chemical Industry. Palo Alti: The Council for Chemical Reasearch, 2000