基因工程和细胞工程测试题---可打印--有答案.doc

基因工程和细胞工程测试题
姓名 成绩
一、选择题（每题5分，共50分）
1．小鼠杂交瘤细胞表达的单克隆抗体用于人体试验时易引起过敏反应,为了克服这个缺陷，可选择性扩增抗体的可变区基因(目的基因）后再重组表达。下列相关叙述正确的是(　　)A．设计扩增目的基因的引物时不必考虑表达载体的序列
B．用PCR方法扩增目的基因时必须知道基因的全部序列
C．PCR体系中一定要添加从受体细胞中提取的DNA聚合酶
D．一定要根据目的基因编码产物的特性选择合适的受体细胞
2．从某海洋动物中获得一基因，其表达产物为一种抗菌性和溶血性均较强的多肽P1。目前在P1的基础上研发抗菌性强但溶血性弱的多肽药物，首先要做的是（　　)
A．合成编码目的肽的DNA片段B．构建含目的肽DNA片段的表达载体
C．依据P1氨基酸序列设计多条模拟肽
D．筛选出具有优良活性的模拟肽作为目的肽
3．某种极具观赏价值的兰科珍稀花卉很难获得成熟种子。为尽快推广种植，可应用多种技术获得大量优质苗，下列技术中不能选用的是(　　）
A．利用茎段扦插诱导生根技术快速育苗B．采用花粉粒组织培养获得单倍体苗
C．采集幼芽嫁接到合适的其他种类植物体上
D．采用幼叶、茎尖等部位的组织进行组织培养
4．如图是单克隆抗体制备流程的简明示意图。下列有关叙述，正确的是(　　）
A．①是从已免疫的小鼠脾脏中获得的效应T淋巴细胞
B．②中使用胰蛋白酶有利于杂交瘤细胞的形成
C．③同时具有脾脏细胞和鼠骨髓瘤细胞的特性
D．④是经筛选培养获得的能分泌特异性抗体的细胞群
5．某兴趣小组拟用组织培养繁殖一种名贵花卉,其技术路线为“取材→消毒→愈伤组织培养→出芽→生根→移栽"。下列有关叙述错误的是（　　)
A．消毒的原则是既杀死材料表面的微生物，又减少消毒剂对细胞的伤害
B．在愈伤组织培养中加入细胞融合的诱导剂，可获得染色体加倍的细胞
C．出芽是细胞再分化的结果，受基因选择性表达的调控
D．生根时，培养基通常应含α－萘乙酸等生长素类调节剂
6．将胡萝卜韧皮部细胞培养成幼苗时，下列条件中不需要的是
A．具有完整细胞核的细胞 B．一定的营养物质和植物激素
C．离体状态 D．导入外源基因
7．芥酸会降低菜籽的品质.油菜有两对独立遗传的等位基因（H和h，G和g）控制菜籽的芥酸含量，下图是获得低芥酸油菜新品种（HHGG）的技术路线。已知油菜单个花药由花药壁（2n）及大量花粉(n）等组分组成，这些组分的细胞都具有全能性。
据图分析，下列叙述错误的是(　　）
A．①、②两过程均需要植物激素来诱导细胞脱分化
B．与④过程相比，③过程可能会产生二倍体再生植株
C．图中三种途径中，利用花粉培养筛选低芥酸植株（HHGG)的效率最高
D．F1减数分裂时，H基因所在染色体会与G基因所在染色体发生联会
8．天然的玫瑰没有蓝色花，这是由于缺少控制蓝色色素合成的基因B，而开蓝色花的矮牵牛中存在序列已知的基因B。现用基因工程技术培育蓝玫瑰。下列操作正确的是(　　）
A．提取矮牵牛蓝色花的mRNA，经逆转录获得互补的DNA,再扩增基因B
B．利用限制性核酸内切酶从开蓝色花矮牵牛的基因文库中获取基因B
C．利用DNA聚合酶将基因B与质粒连接后导入玫瑰细胞
D．将基因B直接导入大肠杆菌,然后感染并转入玫瑰细胞
9．下图示植物组织培养过程。据图分析下列叙述正确的是(　　)
A．⑤植株根尖细胞的全能性比①植株根尖细胞的强
B．②试管的培养基中含有植物生长调节剂,不含有有机物
C．③试管中的细胞能进行减数分裂
D．调节④培养基中植物生长调节剂的比例可诱导产生不同的植物器官
10．下列是应用动物细胞工程获取单克隆抗X抗体的具体操作步骤，其中对单克隆抗体制备的相关叙述错误的是(　　)
①从患骨髓瘤的小鼠体内获取骨髓瘤细胞　②将X抗原注入小鼠体内，获得能产生抗X抗体的B淋巴细胞　③将杂交瘤细胞注入小鼠腹腔内培养　④筛选出能产生抗X抗体的杂交瘤细胞　⑤利用选择培养基筛选出杂交瘤细胞　⑥从小鼠腹水中提取抗体　⑦利用促细胞融合因子促使细胞融合
A．实验顺序应该是①②⑦⑤④③⑥
B．③过程产生多个杂交瘤细胞的过程称为克隆
C．⑦过程获得的细胞均可无限增殖
D．利用细胞融合生产单克隆抗体的过程中通常要经过两次筛选
二、非选择题(共50分）
11．绞股蓝细胞中含有抗烟草花叶病毒(TMV）基因，可以合成一种抗TMV蛋白,叶片对TMV具有抗感染性.烟草是重要的经济作物,由于TMV的感染会导致大幅度减产。研究人员利用转基因技术培育出了抗TMV的烟草，主要流程如下图所示。
(1)科学家首先从绞股蓝细胞中提取抗TMV基因转录的RNA，然后合成目的基因。图中①过程表示________。
（2)由图分析,在过程③构建的重组Ti质粒上应该含有的标记基因是___________基因，重组Ti质粒导入烟草体细胞的方法是____________________。
（3)在过程⑤培养基中除含有卡那霉素及植物必需的各种营养成分外，还必须添加_________________，以保证受体细胞能培养成再生植株。
（4）过程⑥可采取____________________的方法，检测植株是否合成了抗TMV蛋白。在个体水平的鉴定过程中，可通过________________的方法来确定植株是否具有抗性。
12．单纯疱疹病毒I型(HSV－1）可引起水泡性口唇炎。利用杂交瘤技术制备出抗HSV－1的单克隆抗体可快速检测HSV－1。
回答下列问题：
（1）在制备抗HSV－1的单克隆抗体的过程中，先给小鼠注射一种纯化的HSV－l蛋白，一段时间后，若小鼠血清中抗____________________的抗体检测呈阳性，说明小鼠体内产生了_________________反应，再从小鼠的___________中获取B淋巴细胞。将该B淋巴细胞与小鼠的______________细胞融合，再经过筛选、检测，最终可获得所需的杂交瘤细胞，该细胞具有的特点是_______________________________________。
（2)若要大量制备抗该蛋白的单克隆抗体,可在体外对杂交瘤细胞进行培养,也可将该杂交瘤细胞注射到小鼠的______________中使其增殖,再从______________中提取、纯化获得.
（3）通过上述方法得到的单克隆抗体可准确地识别这种HSV－1蛋白，其原因是该抗体具有_________________和_________________等特性。
13．花椰菜易受黑腐病菌的危害而患黑腐病.野生黑芥具有黑腐病的抗性基因。用一定剂量的紫外线处理黑芥原生质体可使其染色体片段化，并丧失再生能力。再利用此原生质体作为部分遗传物质的供体与完整的花椰菜原生质体融合，以获得抗黑腐病杂种植株。流程如下图。据图回答下列问题：
(1）过程①所需的酶是_____________________________。
(2）过程②后,在显微镜下观察融合的活细胞中如有有供体的______________（填细胞器）存在，根据这一特征可作为初步筛选杂种细胞的标志.
（3）原生质体培养液中需要加入适宜浓度的甘露醇以保持细胞具有一定的渗透压，从而维持_______________________。原生质体经过______________再生，进而分裂和脱分化形成____________组织.
（4)若分析再生植株的染色体变异类型，应剪取再生植株和____________________植株的根尖，通过___________、___________、染色和制片等过程制成装片，然后在显微镜下观察比较染色体的形态和数目.
（5)采用特异性引物对花椰菜和黑芥基因组DNA进行PCR扩增，得到两亲本的差异性条带，可用于杂种植株的鉴定。下图是用该引物对双亲及再生植株1～4进行PCR扩增的结果。据图判断，再生植株1～4中一定是杂种植株的有___________。
（6)对杂种植株进行________接种实验,可筛选出具有高抗性的杂种植株。
14．图①表示含有目的基因D的DNA片段长度（bp即碱基对)和部分碱基序列，图②表示一种质粒的结构和部分碱基序列。现有MspⅠ、BamHⅠ、MboⅠ、SmaⅠ4种限制性核酸内切酶,它们识别的碱基序列和酶切位点分别为C↓CGG、G↓GATCC、↓GATC、CCC↓GGG。请回答下列问题:
（1）图①的一条脱氧核苷酸链中相邻两个碱基之间依次由__________________连接.
(2）若用限制酶SmaⅠ完全切割图①中DNA片段，产生的末端是________末端,其产物长度为_____________________________。
（3）若图①中虚线方框内的碱基对被T.A碱基对替换，那么基因D就突变为基因d。从杂合子分离出图①及其对应的DNA片段,用限制酶SmaⅠ完全切割，产物中共有________种不同长度的DNA片段.
（4)若将图②中质粒和目的基因D通过同种限制酶处理后进行连接,形成重组质粒，那么应选用的限制酶是______________________。在导入重组质粒后,为了筛选出含重组质粒的大肠杆菌，一般需要用添加__________________________的培养基进行培养.经检测，部分含有重组质粒的大肠杆菌菌株中的目的基因D不能正确表达，其最可能的原因是_____________________________________________________。
答案
一、选择题(每题5分，共50分）
1．小鼠杂交瘤细胞表达的单克隆抗体用于人体试验时易引起过敏反应,为了克服这个缺陷，可选择性扩增抗体的可变区基因（目的基因）后再重组表达.下列相关叙述正确的是(　　）
A．设计扩增目的基因的引物时不必考虑表达载体的序列
B．用PCR方法扩增目的基因时必须知道基因的全部序列
C．PCR体系中一定要添加从受体细胞中提取的DNA聚合酶
D．一定要根据目的基因编码产物的特性选择合适的受体细胞
D 本题主要考查PCR技术的有关知识。利用PCR技术扩增目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列设计引物，但不需知道目的基因的全部序列,需要考虑载体的序列；因PCR反应在高温条件下进行，故反应体系中需加入耐高温的DNA聚合酶；因某些目的基因编码的产物需经特殊的加工修饰过程,故一定要根据目的基因编码产物的特性选择合适的受体细胞.
2．从某海洋动物中获得一基因,其表达产物为一种抗菌性和溶血性均较强的多肽P1。目前在P1的基础上研发抗菌性强但溶血性弱的多肽药物，首先要做的是（　　)
A．合成编码目的肽的DNA片段B．构建含目的肽DNA片段的表达载体
C．依据P1氨基酸序列设计多条模拟肽
D．筛选出具有优良活性的模拟肽作为目的肽
C 由题中信息“在Pl的基础上研发抗菌性强但溶血性弱的多肽药物"可推知本题考查蛋白质工程的相关知识.根据蛋白质工程的基本途径：从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列（基因）,可推知答案为C.
3．某种极具观赏价值的兰科珍稀花卉很难获得成熟种子。为尽快推广种植，可应用多种技术获得大量优质苗,下列技术中不能选用的是（　　）
A．利用茎段扦插诱导生根技术快速育苗
B．采用花粉粒组织培养获得单倍体苗
C．采集幼芽嫁接到合适的其他种类植物体上
D．采用幼叶、茎尖等部位的组织进行组织培养
B 本题考查对获得大量优质苗的多种技术手段的分析。为了使优质苗的生物性状不发生性状分离，可采用茎段扦插诱导生根技术快速育苗，也可采用将幼芽嫁接到合适的其他种类植物体上的方法或用茎尖或幼叶等部位的组织进行植物组织培养获得大量优质苗;花粉粒是减数分裂的产物，利用花粉粒离体培养得到的是单倍体苗，其高度不育,且会发生性状分离,因此B项方案不能选用。
4．如图是单克隆抗体制备流程的简明示意图.下列有关叙述,正确的是(　　)
A．①是从已免疫的小鼠脾脏中获得的效应T淋巴细胞
B．②中使用胰蛋白酶有利于杂交瘤细胞的形成
C．③同时具有脾脏细胞和鼠骨髓瘤细胞的特性
D．④是经筛选培养获得的能分泌特异性抗体的细胞群
D 本题主要考查单克隆抗体制备的相关知识。①是从已免疫的小鼠脾脏中获得的浆细胞；②中使用聚乙二醇或灭活的病毒等,有利于杂交瘤细胞的形成；③同时具有浆细胞和骨髓瘤细胞的特性；④是经筛选培养获得的能分泌特异性抗体的细胞群.故D项正确。
5．某兴趣小组拟用组织培养繁殖一种名贵花卉,其技术路线为“取材→消毒→愈伤组织培养→出芽→生根→移栽"。下列有关叙述错误的是(　　）
A．消毒的原则是既杀死材料表面的微生物，又减少消毒剂对细胞的伤害
B．在愈伤组织培养中加入细胞融合的诱导剂，可获得染色体加倍的细胞
C．出芽是细胞再分化的结果,受基因选择性表达的调控
D．生根时，培养基通常应含α－萘乙酸等生长素类调节剂
B 本题主要考查植物组织培养的相关知识。在愈伤组织中，因植物细胞含有细胞壁，阻碍了细胞融合，所以此时加入细胞融合的诱导剂,不能获得染色体加倍的细胞；消毒的原则是既杀死材料表面的微生物，又减少消毒剂对细胞的伤害；愈伤组织出芽是细胞分化的结果,而细胞分化的实质是基因的选择性表达;生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键性激素，生根时，培养基通常含有α－萘乙酸等生长素类调节剂.故B项错误.
6．将胡萝卜韧皮部细胞培养成幼苗时,下列条件中不需要的是
A．具有完整细胞核的细胞 B．一定的营养物质和植物激素
C．离体状态 D．导入外源基因
D
7．芥酸会降低菜籽的品质。油菜有两对独立遗传的等位基因（H和h,G和g）控制菜籽的芥酸含量,下图是获得低芥酸油菜新品种(HHGG)的技术路线。已知油菜单个花药由花药壁(2n）及大量花粉（n）等组分组成,这些组分的细胞都具有全能性。
据图分析,下列叙述错误的是（　　）
A．①、②两过程均需要植物激素来诱导细胞脱分化
B．与④过程相比，③过程可能会产生二倍体再生植株
C．图中三种途径中,利用花粉培养筛选低芥酸植株（HHGG)的效率最高
D．F1减数分裂时，H基因所在染色体会与G基因所在染色体发生联会
D ①②两过程是脱分化过程，培养基中需要加入生长素类和细胞分裂素类激素来诱导细胞脱分化，故A项正确；③过程是利用植物花药离体培养获得植株的过程,其中花药壁细胞属于正常的二倍体体细胞，由其获得的植株为二倍体正常植株，④过程是利用花粉粒离体培养获得的，花粉细胞只有一个染色体组，由其获得的植株为单倍体植株，故B项正确;图中的三种途径中,利用花粉培养获得的只有四种品种,比例为1：1：1:1,易筛选出所需品种,故C项正确；H、h和G、g分别是两对独立遗传的等位基因,故两者是位于非同源染色体上的，在减数分裂时,H和G基因所在的染色体不会发生联会，故D项错误。
8．天然的玫瑰没有蓝色花，这是由于缺少控制蓝色色素合成的基因B，而开蓝色花的矮牵牛中存在序列已知的基因B。现用基因工程技术培育蓝玫瑰.下列操作正确的是（　　）
A．提取矮牵牛蓝色花的mRNA，经逆转录获得互补的DNA,再扩增基因B
B．利用限制性核酸内切酶从开蓝色花矮牵牛的基因文库中获取基因B
C．利用DNA聚合酶将基因B与质粒连接后导入玫瑰细胞
D．将基因B直接导入大肠杆菌，然后感染并转入玫瑰细胞
A 可以利用mRNA经逆转录合成目的基因后再进一步扩增,A项正确;因为开蓝色花的矮牵牛基因B的序列是已知的，所以该目的基因宜采用化学方法合成或用聚合酶链式反应（PCR）扩增,而不是从开蓝色花矮牵牛的基因文库中获取，B项错误；目的基因必须与运载体结合后才能导入受体细胞，且需要DNA连接酶缝合,C、D项错误.
9．下图示植物组织培养过程。据图分析下列叙述正确的是(　　）
A．⑤植株根尖细胞的全能性比①植株根尖细胞的强
B．②试管的培养基中含有植物生长调节剂，不含有有机物
C．③试管中的细胞能进行减数分裂
D．调节④培养基中植物生长调节剂的比例可诱导产生不同的植物器官
D ⑤植株根尖细胞的全能性与①植株根尖细胞相同；②试管的培养基中含有植物生长调节剂和有机物等;③试管中的细胞进行的分裂方式为有丝分裂；调节④培养基中植物生长调节剂的比例，可诱导产生根或芽.
10． 下列是应用动物细胞工程获取单克隆抗X抗体的具体操作步骤，其中对单克隆抗体制备的相关叙述错误的是（　　）
①从患骨髓瘤的小鼠体内获取骨髓瘤细胞　②将X抗原注入小鼠体内，获得能产生抗X抗体的B淋巴细胞　③将杂交瘤细胞注入小鼠腹腔内培养　④筛选出能产生抗X抗体的杂交瘤细胞　⑤利用选择培养基筛选出杂交瘤细胞　⑥从小鼠腹水中提取抗体　⑦利用促细胞融合因子促使细胞融合
A．实验顺序应该是①②⑦⑤④③⑥
B．③过程产生多个杂交瘤细胞的过程称为克隆
C．⑦过程获得的细胞均可无限增殖
D．利用细胞融合生产单克隆抗体的过程中通常要经过两次筛选
C 利用促细胞融合因子促使细胞融合,可获得多种融合细胞。其中B淋巴细胞与B淋巴细胞融合的细胞不能无限增殖.
二、非选择题（共50分）
11．绞股蓝细胞中含有抗烟草花叶病毒(TMV）基因，可以合成一种抗TMV蛋白,叶片对TMV具有抗感染性。烟草是重要的经济作物，由于TMV的感染会导致大幅度减产。研究人员利用转基因技术培育出了抗TMV的烟草，主要流程如下图所示。
（1)科学家首先从绞股蓝细胞中提取抗TMV基因转录的RNA，然后合成目的基因.图中①过程表示________。
(2）由图分析,在过程③构建的重组Ti质粒上应该含有的标记基因是___________基因，重组Ti质粒导入烟草体细胞的方法是____________________。
(3）在过程⑤培养基中除含有卡那霉素及植物必需的各种营养成分外，还必须添加_________________,以保证受体细胞能培养成再生植株.
（4）过程⑥可采取____________________的方法，检测植株是否合成了抗TMV蛋白。在个体水平的鉴定过程中，可通过________________的方法来确定植株是否具有抗性。
（1）逆转录(2）卡那霉素抗性　农杆菌转化法
（3)植物激素(4）抗原—抗体杂交　接种烟草花叶病毒
(1）由图可知，①表示逆转录(或反转录）.（2）由图示⑤培养基中含有卡那霉素可知,Ti质粒的标记基因是卡那霉素抗性基因,将基因表达载体(重组Ti质粒)导入植物细胞中常用的方法是农杆菌转化法。(3）将受体细胞培养成再生植株需要进行植物组织培养,培养基中除含有卡那霉素及植物必需的各种营养成分外，还必须添加植物激素。（4）通过抗原—抗体杂交的方法,检测植株是否合成了抗TMV蛋白,在个体水平上，通过接种烟草花叶病毒的方法可以确定植株是否具有抗性.
12．单纯疱疹病毒I型（HSV－1）可引起水泡性口唇炎.利用杂交瘤技术制备出抗HSV－1的单克隆抗体可快速检测HSV－1.
回答下列问题:
（1)在制备抗HSV－1的单克隆抗体的过程中,先给小鼠注射一种纯化的HSV－l蛋白,一段时间后,若小鼠血清中抗____________________的抗体检测呈阳性,说明小鼠体内产生了_________________反应,再从小鼠的___________中获取B淋巴细胞。将该B淋巴细胞与小鼠的______________细胞融合，再经过筛选、检测,最终可获得所需的杂交瘤细胞，该细胞具有的特点是_______________________________________。
（2）若要大量制备抗该蛋白的单克隆抗体，可在体外对杂交瘤细胞进行培养,也可将该杂交瘤细胞注射到小鼠的______________中使其增殖，再从______________中提取、纯化获得.
(3)通过上述方法得到的单克隆抗体可准确地识别这种HSV－1蛋白，其原因是该抗体具有_________________和_________________等特性.
（1） HSV－1蛋白　体液免疫（其他合理答案也可）　脾脏(其他合理答案也可)　骨髓瘤　无限增殖且产生专一抗体（其他合理答案也可）
（2）腹腔　腹水（3）纯度高 　特异性强（其他合理答案也可)
（1）制备单克隆抗体时，需要先给小鼠注射特定抗原（HSV－1蛋白），当小鼠血清中抗HSV－1蛋白的抗体检测呈阳性时,就可从小鼠脾脏中获取B淋巴细胞，将B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，经过筛选和克隆化培养，最终获得既能无限增殖又能产生专一抗体的杂交瘤细胞.（2）单克隆抗体的获取有两条途径，一是从体外细胞培养液中提纯获得,二是将杂交瘤细胞注射到小鼠的腹腔中使其增殖,再从腹水中提取、纯化获得。(3）单克隆抗体具有特异性强、灵敏度高、纯度高等特点。
13．花椰菜易受黑腐病菌的危害而患黑腐病.野生黑芥具有黑腐病的抗性基因.用一定剂量的紫外线处理黑芥原生质体可使其染色体片段化，并丧失再生能力。再利用此原生质体作为部分遗传物质的供体与完整的花椰菜原生质体融合，以获得抗黑腐病杂种植株。流程如下图.据图回答下列问题：
(1)过程①所需的酶是_____________________________。
（2)过程②后，在显微镜下观察融合的活细胞中如有有供体的______________（填细胞器)存在，根据这一特征可作为初步筛选杂种细胞的标志.
(3)原生质体培养液中需要加入适宜浓度的甘露醇以保持细胞具有一定的渗透压，从而维持_______________________。原生质体经过______________再生,进而分裂和脱分化形成____________组织。
（4)若分析再生植株的染色体变异类型，应剪取再生植株和____________________植株的根尖，通过___________、___________、染色和制片等过程制成装片，然后在显微镜下观察比较染色体的形态和数目。
(5）采用特异性引物对花椰菜和黑芥基因组DNA进行PCR扩增，得到两亲本的差异性条带，可用于杂种植株的鉴定。下图是用该引物对双亲及再生植株1～4进行PCR扩增的结果.据图判断，再生植株1～4中一定是杂种植株的有___________。
（6）对杂种植株进行________接种实验，可筛选出具有高抗性的杂种植株。
（1)纤维素酶和果胶酶(2）叶绿体（3)原生质体完整性　细胞壁 愈伤
(4）双亲(或花椰菜和黑芥)　解离　漂洗（5）1、2、4（6）黑腐病菌
本题考查植物细胞工程、染色体变异的实验鉴定以及高抗性的杂种植株的筛选等相关知识。（1)去除细胞壁获得原生质体需要用纤维素酶和果胶酶处理.（2）叶肉细胞含有叶绿体，因此通过PEG诱导融合的杂种细胞应含有叶绿体,以此作为初步筛选杂种细胞的标志.(3)原生质体失去了细胞壁的保护作用，因此原生质体培养液中需要加入适宜浓度的甘露醇，使原生质体处于等渗溶液中，以维持原生质体正常形态。原生质体经过细胞壁再生，进而分裂和脱分化形成愈伤组织.（4）要判断染色体变异的类型,应剪取再生植株、花椰菜和黑芥植株的根尖,通过解离、漂洗、染色、制片等过程制成装片,然后进行显微观察比较染色体的形态和数目。(5）根据两亲本的差异性条带，可知再生植株1、2和4既有花椰菜的条带，又有黑芥的条带，因此再生植株1、2和4一定为杂种植株.（6)要筛选出高抗性的杂种植株，应进行相应的病原体接种实验，即接种黑腐病菌。
14．图①表示含有目的基因D的DNA片段长度（bp即碱基对)和部分碱基序列，图②表示一种质粒的结构和部分碱基序列.现有MspⅠ、BamHⅠ、MboⅠ、SmaⅠ4种限制性核酸内切酶，它们识别的碱基序列和酶切位点分别为C↓CGG、G↓GATCC、↓GATC、CCC↓GGG。请回答下列问题：
（1）图①的一条脱氧核苷酸链中相邻两个碱基之间依次由__________________连接。
（2）若用限制酶SmaⅠ完全切割图①中DNA片段，产生的末端是________末端,其产物长度为_____________________________。
（3）若图①中虚线方框内的碱基对被T。A碱基对替换,那么基因D就突变为基因d。从杂合子分离出图①及其对应的DNA片段,用限制酶SmaⅠ完全切割，产物中共有________种不同长度的DNA片段.
(4）若将图②中质粒和目的基因D通过同种限制酶处理后进行连接,形成重组质粒，那么应选用的限制酶是______________________。在导入重组质粒后,为了筛选出含重组质粒的大肠杆菌,一般需要用添加__________________________的培养基进行培养.经检测,部分含有重组质粒的大肠杆菌菌株中的目的基因D不能正确表达，其最可能的原因是_____________________________________________________。
（1）脱氧核糖、磷酸、脱氧核糖（2）平　537 bp、790 bp、661 bp
(3）4(4)BamHⅠ　抗生素B　同种限制酶切割形成的末端相同,部分目的基因D与质粒反向连接
(1）在一条脱氧核苷酸链上,相邻两个脱氧核苷酸之间通过3，5。磷酸二酯键相连,所以相邻碱基之间通过脱氧核糖、磷酸、脱氧核糖相连接。(2）SmaⅠ识别并切割的序列为CCC↓GGG，所以产生的末端为平末端,经SmaⅠ切割后，DNA片段会形成三个小的DNA片段，按切割位点计算分别是：534 bp＋3 bp＝537 bp;796 bp－3 bp－3 bp＝790 bp；658 bp＋3 bp＝661 bp.(3）杂合子基因型为Dd.用SmaⅠ切割基因D，会形成537 bp、790 bp、661 bp三种类型。题图①中虚线方框内C-G被T—A替换，失去了一个酶切位点，则会被切割成534 bp＋796 bp－3 bp＝1 327 bp，和658 bp＋3 bp＝661 bp。所以一共会得到4种类型的片段.(4)如果要获得完整的目的基因可用BamHⅠ和MboⅠ切割，但是MboⅠ会破坏抗生素A抗性基因和抗生素B抗性基因，质粒会失去标记基因，无法筛选，所以只能用BamHⅠ切割.用BamHⅠ切割后破坏了抗生素A抗性基因，所以质粒上存在的标记基因是抗生素B抗性基因，因此，在加入抗生素B的培养基上进行培养、筛选，经过同种限制酶切割后会产生相同的末端，部分目的基因与质粒反向连接导致基因无法正常表达。
10