微生物的实验室培养——总结.doc

微生物的实验室培养
一、 培养基：
1、 化学成分（1）一般成分：水 、 无机盐 、 碳源 、 氮源 。
碳源:能为微生物的代谢提供碳元素的物质。
无机碳源：CO2、NaHCO3
有机碳源：糖类、石油、花生粉饼等
异养微生物只能利用有机碳源,同时其又是能源。单质碳不能作为碳源。
（2） 特殊营养物质(生长因子）：如，培养乳酸杆菌时需要在培养基中添加维生素
2、 制备:
（1） 方法步骤：计算、称量、溶化、（调节PH）、灭菌、倒平板
（2） 灭菌方法：高压蒸汽灭菌法（高压蒸汽灭菌锅、一般压力100KPa，温度121℃，使用时应注意将锅内的冷空气排除干净，否则达不到预订的温度）
（3） 关于倒平板：
a需要冷却到 50℃左右时（即不烫手）,才能用来倒平板。
b整个过程在酒精灯火焰旁进行.
c要使锥形瓶的瓶口通过火焰,通过灼烧灭菌,防止瓶口的微生物污染培养基。
d平板冷凝后，为什么要将平板倒置原因：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠,将平板倒置，既可以防止培养基表面的水分过度地挥发,又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染.
e在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位,空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生,因此最好不要用这个平板培养微生物.
（4） 制备成功的标准：未接种的培养基在恒箱中保留1—-2天，无菌落生长。
3、 种类
（1） 按照物理性质可分为液体培养基 半固体培养基和固体培养基.
液体体培养基应用于工业或生活生产，固体培养基应用于微生物的分离和鉴定，半固体培养基则常用于观察微生物的运动及菌种保藏等.
(2）按照培养基的用途，可将培养基分为选择培养基和鉴定培养基。
注意:
(1）对于异养微生物来说含C、H、O、N的有机物即是碳源又是氮源和能源。
(2）NH3可做氮源又可作为某些微生物（如硝化细菌）的能源
（3）CO（NH2)2是氮源但不是碳源
二、无菌技术
（1）获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌的入侵
(2）目的：用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，有效避免操作者自身被微生物感染。
（3）消毒与灭菌
三、微生物的分离纯化培养技术
1、目的：关键步骤是接种
2、培养基为固体培养基,因为菌落只能在固体培养基上形成。
3、方法：用平板划线法和稀释涂布平板法接种的目的是：使聚集在一起的微生物分散成单个细胞,从而能在培养基表面形成单个的菌落，以便于纯化菌种。
（1)平板划线法：原理、优缺点
注意:
a不同阶段灼烧接种环的目的：操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时,接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少,以便得到菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种,避免细菌污染环境和感染操作者。
b灼烧接种环之后，要等其冷却后再进行划线以免接种环温度太高,杀死菌种。
c不要将最后一区的划线与第一区相连。
d在作第二次以及其后的划线操作时,应从上一次划线的末端开始划线目的是能使细
菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落.
（2） 稀释涂布平板法：原理、优缺点
注意：（1）统计的菌落数目往往比实际活菌的实际数目低。这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到只是一个菌落。
（2）接种时可能的失误操作：涂布不均匀
4实例:分解纤维素的微生物的分离
（1） 方法：刚果红染色法
种类:一种是先培养微生物,再加入刚果红进行颜色反应，另一种是在倒平板时就加入刚果红
（2)原理:刚果红是一种染料，它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物,但并不和水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应.当在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红能与培养基中的纤维素形成红色复合物。当纤维素被纤维素酶分解后，刚果红－纤维素的复合物就无法形成，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈。这样就可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌
(3)标志
(4）过程
土壤取样和制备培养基→选择培养→梯度稀释→将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上→挑选产生透明圈的菌落
注意:a土壤采集: 选择富含纤维素的环境。所用工具要灭菌
b选择培养:此步是否需要，应根据样品中目的菌株数量的多少来确定。
目的是以增加纤维素分解菌的数量。
液体的选择培养基【振荡培养（能提高培养液中溶解氧的含量同时可使菌体与培养液充分接触，提高营养物质的利用率）,直至出现浑浊】
（5） 纤维素酶是一种复合酶
四、 微生物的筛选和计数
1、筛选
（1） 原则:
a选择性培养基：根据选择培养的菌种的生理代谢特点加入某种物质以达到选择的目的.
例如，培养基中不加入有机物可以选择培养自养微生物；培养基中加入抗生素。
改变培养基的成分：如以尿素为唯一氮源,以纤维素为唯一碳源
b改变微生物的培养条件。如温度、PH、O2等
（2） 鉴定
2、计数
（1）显微镜直接计数.原理、方法、缺点
数值可能比实际值偏高，原因______________________________
（3） 间接计数法(活菌计数法)-—稀释涂布平板法。原理、公式、操作
注意a为了保证结果准确和有说服力，一般选择三个稀释度的菌液；
设置重复组；同一稀释度下至少涂三个平板3~5 个平板,并取平均值（如果重复结果不一致意味着有误需重新做,一般在同一稀释度下至少有2个数据接近才算比较成功)
一般选择菌落数在 30~300 的平板进行计数，
b统计的菌落数往往比活菌的实际数目低，原因是__________________________
因此,统计结果一般用菌落数而不是活菌数来表示。
3、实例：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
（1） 原理(2）计数
(3）流程
（1）土壤取样：
(2)配制土壤溶液和制备培养基
（3)系列稀释：不同的微生物稀释度不同
第一次时可将稀释的范围放宽以保证能从中选出菌落数在 30~300 的平板.
（4） 涂布平板与培养：通常在恒温培养箱中培养
不同种类的微生物,往往需要不同的培养温度和培养时间。
(5)菌落计数:
每隔 24 小时统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果，这样可以防止因培养时间不足而导致一楼菌落的数目。
一般来说，在一定的培养条件下（相同的培养基、温度及培养时间），同种微生物表现出稳定的菌落特征.形状、大小、隆起程度、颜色.
4、设置对照
(1)设置对照的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度.对照验是指除了被测试的条件以外，其他条件都相同的实验，其作用是比照试验组，（2）排除任何其他可能原因的干扰，证明确实是所测试的条件引起相应的结果。
a用来判断选择培养基是否起到了选择作用需要设置的对照是接种了的牛肉膏蛋白胨培养基。
b设置空白对照排除培养基污染产生的影响
五、菌种的保存
(1)对于频繁使用的菌种，可以采用临时保藏的方法。
①临时保藏方法
将菌种接种到试管的固体斜面培养基上，4℃的冰箱中保藏.
②缺点：这种方法保存的时间不长,菌种容易被污染或产生变异。
（2)对于需要长期保存的菌种,可以采用甘油管藏的方法。放在－20℃的冷冻箱中保存。
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