水质粪大肠菌群操作注意事项-作业指导书1.doc
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1、xxxxx环境检测有限公司第1版 第0次修改 作业指导书编制人: 批准人: 批准发布日期:标题:水质 粪大肠菌群的测定 多管发酵法作业指导书水质粪大肠菌群的测定 多管发酵法作业指导书 本试验基本操作参照HJ/T 347-2007 水质粪大肠菌群的测定 多管发酵法和滤膜法(试行)制定此作业指导书.1.培养基、试剂与仪器 本标准所用试剂除另有注明外,均为符合国家标准的分析纯化学试剂;实验用水为新制备的去离子水;操作者必须建立“无菌概念”和掌握“无菌操作技术,所有涉及微生物操作的器皿必须进行灭菌,试验中避免所有可能造成微生物污染的操作。 单倍乳糖蛋白胨培养液:称取23.0g乳糖蛋白胨培养基于1L蒸馏
2、水中,加热煮沸至完全,分装于含有倒置的玻璃倒管(杜氏小管)的20x200mm试管中,每试管10ml(注意玻璃倒管中不能有气泡,若出现气泡,可用手指轻弹玻璃管)塞紧塞子,置于高压蒸汽灭菌器中,在115灭菌20min,贮存于暗处备用。 三倍乳糖蛋白胨培养液:称取69。0g乳糖蛋白胨培养基于1L蒸馏水中(注意煮沸步骤可能糊底,也可用二倍乳糖蛋白胨培养液替代),其它操作同上。 EC培养液:称取37。0gEC肉汤于1L蒸馏水中,加热煮沸至完全,分装于含有倒置的小玻璃管的试管中,每管10ml(操作方法同单倍乳糖蛋白胨营养液),于高压蒸汽灭菌器中,在115灭菌20min,贮存于暗处备用。 伊红美蓝培养基:称
3、取36。0g伊红美蓝培养基于1L蒸馏水中,加热煮沸至完全溶解后,分装于三角烧瓶中。于高压蒸汽灭菌器中,在121灭菌15min,贮存于暗处备用。 生理盐水:在烧杯中配制适量的质量分数为0。9%的生理盐水,分装于试管中,每试管9.5mL,于高压蒸汽灭菌器中,在121灭菌15min,贮存于暗处备用。(本实验室中灭菌锅蒸发量为0。5mL) 培养基的存放:在密封瓶中的脱水培养基成品要存放在大气湿度低、温度低于30的暗处,存放时应避免阳光直接照射,并且要避免杂菌侵入和液体蒸发。当培养液颜色变化,或体积变化明显时废弃不用。本实验室将培养基放置在4冰箱中保存。 实验所需仪器:超净工作台(有条件的实验室建议使用
4、生物安全柜)、恒温培养箱、高压蒸汽灭菌器、冰箱、酒精灯、天平、电炉、500mL广口瓶、烧杯、玻璃棒、玻璃发酵管、试管架、移液管、移液枪、接种环等,详见附件.2。试验前期准备 器皿灭菌(高压蒸汽灭菌):所用采集水样的广口玻璃瓶、玻璃试管、移液管、玻璃棒、移液枪枪头等器皿均需放入高压锅灭菌. 采样广口玻璃瓶:将清洗干净的采样瓶盖好瓶盖,用牛皮纸将瓶盖、瓶顶和瓶颈处包裹好,用绳子绑好;培养皿:将清洗干净的培养皿,用牛皮纸包裹好,用绳子绑好。置于121的高压蒸汽灭菌器灭菌15min。培养皿:(湿热灭菌后4h内采集水样.本实验室采用干热灭菌法,145灭菌4。5h.可保存一个月,一个月后重新灭菌.采样瓶要
5、抽样做无菌验证试验。) 玻璃试管(已经装好培养液):将7支玻璃试管一捆用牛皮纸将上部包裹好,用绳子绑好。生理盐水:将10支玻璃试管一捆用牛皮纸将上部包裹好,用绳子绑好。移液枪枪头(将枪头插入枪盒后,用牛皮纸将其包裹好,用绳子绑好。)置于的高压蒸汽灭菌器121灭菌15min。(将包裹好灭菌后的枪盒用低温(4572)烘干,存放时间更长。) 采样:采取水样时严格按照无菌操作进行,可握住瓶子下部直接将已灭菌的带盖采样瓶插入水中,约距水面1015cm处,拔瓶盖,瓶口朝水流方向,使水样灌入瓶内然后盖上瓶盖,将采样瓶从水中取出。如果没有水流,可握住瓶子水平前推,直到充满水样为止。采好水样后,迅速盖上瓶盖和包
6、装纸。(采样体积建议450mL500mL最好,采自来水或含余氯水样时采样瓶(500mL)在灭菌前应加1.5硫代硫酸钠2mL。)采好的水样,应迅速运往实验室,进行检验,一般从取样到检验不宜超过2h,否则应使用10以下的冷藏设备保存样品,但不得超过6h。3.水样接种量 将水样充分混匀后,根据水样污染的程度确定水样接种量。每个样品至少用三个不同的水样量接种。同一接种水样量要有五管。 相对未受污染的水样(自来水、水源水、直饮水)接种量为10mL、1mL、0.1mL。受污染水样(生活污水)接种量根据污染程度接种1mL、0。1mL、0。01mL或0.1mL、0。01mL、0.001mL等。(根据实验经验,
7、经过紫外消毒的水样取0。1mL、0。01mL、0.001mL体积进行检测,可根据水样的洁净度适当调整取样体积。)如接种体积为10mL,则试管内应装有三倍浓度乳糖蛋白胨培养液5mL(本实验室采用:二倍浓度乳糖蛋白胨培养液10mL);如接种量为1mL或少于1mL,则可接种于普通浓度的乳糖蛋白胨培养液10mL中。4.初发酵试验 将水样分别接种到盛有乳糖蛋白胨培养液的发酵管中.在370。5下培养24h2h.产酸和产气的发酵管表明试验阳性(产酸发酵管由紫色变为黄色)。如在倒管内产气不明显,可轻拍试管,有小气泡升起的为阳性。(一般生活污水在接种2-4h后发酵管中有明显的大量气泡产生。)5。平板分离(推荐步
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