新型HDAC抑制剂——苯达莫司汀化合物Nl-101的抗白血病作用及机制研究doc资料.docx
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1、此文档收集于网络,如有侵权请联系网站删除研究生优秀毕业论文此文档仅供学习和交流中国医学科学院北京协和医学院(清华大学医学院)博士学位论文中文摘要研究目的:开发具有生物活性高、毒性低等特点的新药一直是肿瘤治疗研究领域的 热点,其中分子合成药物由于能够克服传统化疗药物的缺陷而备受关注。NL101 是一种连接组蛋白去乙酰化酶抑制剂SAHA以及烷化剂苯达莫司汀的活性基团而 合成的化合物。本文探讨这种化合物在体外和体内对于白血病细胞的杀伤作用以及 相关分子机制。研究方祛:采用MTT法检测NL101、SAHA和苯达莫司汀对多种白血病细胞系增 殖能力的影响,用SPSS软件计算半数抑制剂量(ICs0),用Co
2、mpuSyn软件计算 SAHA和苯达莫司汀的药物联合指数(CI);用流式细胞术分析药物处理后细胞的 周期和凋亡变化;Western blot检测药物处理后组蛋白H3乙酰化水平,以及蛋白凋亡和DNA损伤相关蛋白包括YH2AX、PARP、caspase3、Bax、Bcl2和BclxL的 表达;Ficoll法分离病人原代细胞,瑞氏染色观察细胞经药物处理后的形态改变。 体内实验部分,通过逆转录病毒感染构建共表达AMLlETO和CKIT突变的移植白血病小鼠模型,给予NL101、苯达莫司汀和SAHA注射治疗,动态监测小鼠体 重以及体内白血病细胞浸润情况,记录各组小鼠生存期。研究结果:在体外实验中:(1)苯
3、达莫司汀和SAHA在白血病细胞中具有协同作 用。(2)NL101对多种白血病细胞系的生长有明显的抑制作用,其中Kasumi1 和NB4细胞的敏感性最为显著;NL一101对正常细胞系的作用较小,显示出对肿瘤 细胞作用的选择性;NL一101的抗增殖能力显著高于苯达莫司汀,与SAHA没有显 著差异。(3)NL101导致白血病细胞周期阻滞于S期,以及显著的细胞凋亡。(4) NL101的细胞毒性作用在分子水平上表现为激活依赖caspase3的凋亡通路以及 Bcl2家族促凋亡蛋白;NL101能增加DNA损伤标志蛋白YH2AX和乙酰化组蛋白H3的表达。(5)NL101能诱导急性髓系白血病患者的原代细胞发生D
4、NA损伤和 细胞凋亡。在体内实验中: (1)成功建立共表达AMLlETO和CKIT突变的移植 白血病小鼠模型,造血器官中有大量原始细胞(c硒t+、Grl一、CDllb-)浸润。(2)NL101能抑制t(8;21)白血病细胞的增殖和浸润,显著延长白血病小鼠的生存期,具有比苯达莫司汀和SAHA更强的抗自血病活性。(3)NL101对小鼠体重没有显著影响,小鼠的耐受性良好。研究结论:由SAHA和苯达莫司汀的活性基团合成的新型药物NL一101,在体内及万方数据中国医学科学院北京协和医学院(清华大学医学院)博士学位论文体外实验中均具有抑制白血病细胞增殖以及诱导细胞凋亡的生物学效应。针对作用 机制的研究显示
5、NL101具有抑制组蛋白去乙酰化酶和破坏DNA结构的双重活性。关键词:新型合成药物;组蛋白去乙酰化酶抑制剂,I苯达莫司汀;凋亡;急性髓系白血病万方数据中国医学科学院一E京协和医学院(清华大学医学院)博士学位论文AbstractA novel SAHAbendamustine hybrid induces apoptosis of leukemia cells objective:Development of novel drugs with powerful biological activity and lowtoxicity has been a hot area for the rese
6、arch of cancer therapyHybrid anticancer drugs are of great therapeutic interests as they Can potentially overcome the deficiencies of conventional chemotherapy drugs and improve the efficacyWe reported a novel hybrid NL一1 0 1 which comprises the chemoactive groups of histone deacetylase inhibitor SA
7、HA and alkylating agent bendamustineIn this study,we tested the in vitro and in vivo anticancer effect of NL一1 0 1 on acute myeloid leukemia cells,and investigated its possible related mechanismsMethods:Cell lnhibition rate of leukemia cells treated with NL-1 0 1SAHA and bendamustine was determined
8、by MTT assayThe inhibitory concentration of the drug uesd to cause 50inhibition of cell growth(IC50)was calculated by SPSS statistical softwareThe combination index(CI)of SAHA and bendamustine was calculated by CompuSyn softwareThe cell cycle distribution and apoptosis rate were detected by flow cyt
9、ometryWestem blot analysis was used to analyze the level of acety7lated H3 as well as cell signaling proteins related apoptosis and DNA damage,including Y-H2AX,PARP,caspase-3,Bax,Bcl一2 and Bcl-xLBone marrow samples of AML patients and healthy donors were isolated by Ficoll gradient solution and the
10、morphology was observed witllWright stainingFor in vivo experiment,transplantable mice leukemia model COexpressing AMLl一ETO and HyC-K【TD816V were generated by retroviral infection Leukemia mice received NL-1 0 1,bendamustine and SAHA treatmentThe body weight and the infiltration of GFP+cells were mo
11、nitored,and the survival time of each mouseWas recordedResults:In vitro study:(1)The synergistical effect of SAHA and bendamustine Was proved in leukemia cells(2)NL一1 0 1 exhibited efficient antiproliferative activity on myeloid leukemia cells especially Kasumi-1 and NB4 cells with resistance onnon-
12、malignant cellsThe potency of NL一1 0 1 showed far superior to that of bendamustine, while similar with SAHA(3)NL-1 0 1 caused S phase arrest and significant apoptosis of 4万方数据中国医学科学院北京协和医学院(清华大学医学院)博士学位论文Kasumi-1 and NB4 cells(4)The activation of caspase-3 dependent apoptosis pathway and members of
13、Bcl一2 family proteins contributed to its cytotoxic effectIn addition, NL-1 0 1 presented both the properties of HDAC inhibition and DNA damage,as assessedby the acet)rlation of histone H3 and DNA double-strand breaks marker 7-H2AX(5)NL-1 0 1 induced apoptosis and DNA damage in primary cells from acu
14、te myeloidleukemia(AML)patientsIn vivo study:(1)Recipient mice COexpressing AMLl-ETO and HyC-KITD816V developed aggressive acute leukemia with extensive infiltration of immature blast cells(c-Kit+,Grl一,CDl lb-)in hematopoietic organs(2)NL一101 treatment could reduce the infiltration of leukemia cells
15、 and significantly prolong the survival time of leukemia mice,showing the enhanced efficacy than bendamustine and SAHA(3)Recipient mice couldtolerate the NL1 0 1 treatment without significant weight lOSSConclusions:The novel SAHAbendamustine compound NL-1 0 1 exhibited potent anti-proliferative and
16、pro-apoptotic activities towards AML cells both in vitro andn vivo It possessed the dual mechanisms of HDAC inhibition and DNA damageKeywords:novel hybrid;HDAC inhibitor;bendamustine;apoptosis;acute myeloidleukemia5万方数据中国医学科学院北京协和医学院(清华大学医学院)博士学位论文本论文研究新型组蛋白去乙酰化酶抑制剂苯达莫司汀合成化合物NL101在体 内及体外的抗白血病活性,并初步探
17、讨其作用机制。主要分为两部分:第一部分, 体外NL101抗白血病作用的评价及其分子机制的研究;第二部分,建立t(8;21)白 血病小鼠模型并在体内评价NL101功能。第一部分体外NL-101抗白血病作用的评价及其分子机制的研究万方数据中国医学科学院北京协和医学院(清华大学医学院)博士学位论文前言迄今为止,化疗仍然是临床治疗实体肿瘤和恶性血液疾病最有效的方法。然而, 靶向性差以及严重的毒副作用制约了传统的化疗药物的发展,高效低毒的新型抗肿 瘤药物的研发一直是肿瘤领域的研究热点。组蛋白去乙酰化酶抑制剂(histone deacetylases inhibitor,HDACi)是近年来日 益受到关注
18、的一类新型抗肿瘤药物,其靶向性强、毒性较低,较传统细胞毒药物具 有明显优势。组蛋白去乙酰化酶(HDACs)通过调节组蛋白的乙酰化水平,以及一 系列非组蛋白成分,包括基因转录因子和参与调节细胞增殖、迁移和死亡的蛋白表 达,参与基因的转录调控【131。在白血病和淋巴瘤中,HDACs过度表达并被转录因 子异常募集,导致靶基因的转录受到抑$1J4,5】。因此,HDACi通过抑制HDACs的活 性,上调组蛋白的乙酰化水平,重新激活抑癌基因的转录和表达,能够发挥抗白血 病细胞的生物学效应【6】;并且针对于正常细胞和肿瘤细胞之间的差异,HDACi达到 了高选择性、低毒性的治疗效果。目前HDACs成为抗肿瘤药
19、物最具潜力的靶点之 一,可以从多个方面发挥抗白血病作用,包括抑制肿瘤细胞生长,阻滞细胞周期, 诱导细胞分化和凋亡【7-9】。异羟肟酸类化合物是目前研究最为广泛的一类组蛋白去乙 酰化酶抑制剂,其中vorinostat(SAHA)作为首个获得美国FDA批准的组蛋白去 乙酰化酶抑制剂,用于治疗皮肤T细胞淋巴瘤(Cutaneous T-cell lymphoma,CTCL), 显示出较好的临床疗效以及患者耐受性【lo,11】。众多研究显示,组蛋白去乙酰化酶抑制剂与传统的化疗药物联用,能够增加细 胞对药物的敏感性【l215】。比如entinostat(MS。275)和苯达莫司汀(bendamustine
20、)能 协同抑制多发性骨髓瘤(mutiple myeloma,MM)细胞的增殖,并克服对传统化疗 药物的耐药16】。苯达莫司汀是一种具有氮芥基团和苯并咪唑的双功能氮芥衍生物,能直接破坏DNA结构,诱导细胞凋亡,并且与其他细胞毒药物无交叉耐药17-19。 苯达莫司汀自上市以来被广泛用于血液系统肿瘤以及乳腺癌等实体肿瘤的治疗。临 床试验中与其他一线治疗药物联用,在治疗非霍奇金淋巴瘤(nonHodgkinlymphoma,NHL)、慢性淋巴细胞白血病(chronic lymphoid leukemia,CLL)和多发性骨髓瘤等淋巴系统肿瘤中得到了良好的效果20-24。 理论上,HDACi通过开放染色质
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