新型Bcr-Abl和SrcAbl抑制剂抗慢性髓性白血病的实验研究教程文件.docx
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1、此文档收集于网络,如有侵权请联系网站删除中国医学科学院北京协和医学院博士学位论文刘鹤tetrazolium bromideODOptical Density光密度值PBSPhosphate Buffered Saline磷酸盐缓冲液PCRPolymerase Chain Reaction聚合酶链式反应PgpP-glycoproteinP一糖蛋白PIPropidium Iodide碘化丙锭 P13KPhosphatidylinoskol 3-kinase磷脂酰肌醇激酶 PMSFPhenylmethylsulfonylfluoride苯甲基磺酰氟砌、笛eARNA酶AlU-PCR甓e、:erSe n
2、-黜c1p10n。p01yme勰逆转录聚合酶链式反应chaln reactlonSDSSodium dodeylsulfate十二烷基硫酸钠 SDSPAGESds polyacrylamide gel electrophoresisSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 TAETrisCI acetate EDTA bufferTAE缓冲液TE bufferTrisC l EDTA bufferTE缓冲液 TEMEDN,N,NN-Tetmmethyl Ethylenediamine四甲基氨基乙胺“STrihydroxymethhylamino methane三羟甲基氨基甲烷VCRVincristine长春新
3、碱2此文档仅供学习和交流中国医学科学院北京协和医学院博士学位论文刘鹤独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。论文中除了特别加以标注和致谢的地方外,不包含其他人已经发表或撰写 过的研究成果,也不包含为获得其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我 一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢 意。学位论文作者签名: 参)弘 签字日期:仰缪年6月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解j塞坯塑医堂瞳有关保存、使用学位论文的管理 办法。有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘,允许论文被查 阅和借阅。本人授权
4、j塞垃塑医堂喧可以将学位论文的全部或部分内容编入有关 数据库进行检索,可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名:导师签名: 仳嘭知签字日期:7谚 月日签字日期:2沙。脾石月厂D日学位论文作者毕业后去向:工觯位:如待新钙澌丫心电话:通讯地址:邮编:中国医学科学院北京协和医学院博士学位论文刘鹤第一部分:新型苯胺嘧啶类化合物FABl 07抗慢性髓性白 血病的实验研究PartI:The activity of FABl07,a novel BcrAbl_l-lllinhibitoragainst ChronlC myel02enous
5、 lenkemla3中国医学科学院北京协和医学院博士学位论文刘鹤摘要慢性髓性白血病(chrollic myelogenous leukemia,CML)是一种血液系统恶性增 生性疾病。以细胞内出现嵌合蛋白BcrAbl为主要特征。BcrAbl蛋白具有持续活化 的酪氨酸激酶活性,激活下游多条信号传导通路,引起疾病的发生。伊马替尼(Imatinib,Gleevec,STI571)属一种Abl酪氨酸激酶抑制剂,它是 第一个小分子靶向性治疗药物。体内、外实验表明,Imatinib通过抑制Bcr-Abl自 身磷酸化和底物磷酸化,而抑制细胞增殖和诱导凋亡。Imatinib在临床上用于费城 染色体阳性(Phi
6、ladelphia chromosome positive,Ph+)的CML患者。由于其所产生的较好血液学和细胞遗传学缓解(尤其是慢性期CML患者),Imatinib已经作为新近诊断的CML患者的一线药物。但是Imatinib在治疗CML急变期及ph+的急性淋 巴细胞白血病患者时效果却并不理想,而且随着临床的用药,Imatinib逐渐出现耐 药。因此,这促使人们寻找新的治疗CML和Imatinib耐药的CML的药物。AMNl07属第二代Abl抑制剂,许多临床前研究结果已经显示出非常好的效果。 研究表明,在许多BcrAbl转化的造血细胞系,AMNl07对Bcr-Abl自身磷酸化和 增殖的抑制较I
7、matinib高2050倍。而且AMNl07对很多Imatinib耐药的BcrAbl蛋白突变株有很强的抑制作用。目前AMNl07正在进行临床试验,但已有些病例出 现AMNl07耐药,其机制是否与Imatinib耐药相同还在进一步研究中,因此Novartis 制药公司又继续研发更强的Abl抑制剂,其中368485就是Novartis制药公司研制 的一种新型此类化合物,其药物活性尚没有相关报道。本研究就是探讨一种新型苯胺嘧啶类衍生物FABl07在体内、外对CML细胞系K562细胞和K562耐Imatinib细胞系K562G30的抑制作用。本研究采用MTT方法观察了FABl07与Imatinib和3
8、68485相比较对K562和 K562G30细胞的生长抑制作用。研究结果表明,FABl07抑制K562和K562G30 细胞生长,IC50分别为O03 la molL和007 u molL。FABl07对2种细胞的抑制作用强于Imatinib 0c50分别为031 la molL和632la molL),而与368485(IC50分别 为O02 1t molL和0082 la molL)相当。裸鼠中空纤维模型实验进一步证实,FABl07可以抑制K562和K562G30细 胞在裸鼠体内的生长。给药7天后,与对照组相比,FABl07的3个剂量组(15 lZ molkg、30 lZ molkg和45
9、 u molkg)在体内对K562及K562G30细胞生长均呈剂量依赖性的抑制作用(P90of CML patientsThe Ph produces BcrAblfusion protein,which displays constitutive tyrosine kinase activity and activates several signaling transduction pathwaysThe 2-phenylamino-pyrimidine derivative Imatinib(Gleevec,STl571)Was developed as the first molecu
10、larly targeted therapy that specifically inhibits the Bcr-Abl tyrosine kinase activity in patients with Ph positive(Ph3 CMLImatinib acts by revoking the effects of the Bcr-Abl oncoprotein through inhibition of Bcr-Ablautophosphorylation,inhibition of proliferation,and induction of apoptosisDue to it
11、s excellent hematologic and cytogenetic responses,particularly in patients with cllromc phase CML,Imatinib has moved towards first-line treatment for newly diagnosed CML However,reponses to Imatinib in patiems with more advanced disease are generally transientNevertheless,resistance to the drug has
12、been frequently reportedAs a result,avariety of strategies derived from structural studies of the Abl-Imatinib complex havebeen developed,resulting in the design of novel Abl inhibitorsSeveral preclinical studies have shown promising results for second generation Abl inhibitor AMN 1 07Using numerous
13、 Bcr-Abl tranformed hematopoietic cell lines, AMN1 07 Was found to be 2050 fold more potent compared with Imatinib in reduction of both autophosphorylation and proliferationNevertheless,cell lines expressing the Imatinibresistant Bcr-Abl mutants can be inhibited by AMN1 07AMN1 07 has made its way in
14、to clinical trialUnfortunately,resistance to AMN 1 07 reduced inhibition of cell growthThe molecular mechanisms underlying resistance still need to be determinedIn this study,we investigated the activity of a novel phenylamino pyrimidine derivative FAB 1 07,compared with Imatinib and 368485,in both
15、K562 and K562G30 eelIsEffects of FAB 1 07 on the growth of K562 and K562G30 cells were analyzed by MTT assayThe growth of K562 and K562G30 cells Was inhibited by FAB 1 07、航t11 the IC50 value of 003 U molL and 007 II molL。respectivelyThe inhibition Was stronger6中国医学科学院北京协和医学院博士学位论文刘鹤than that of Imat
16、inib(ICs0:O3 1 IX molL and 632 IX molL)and equal to 368485(IC50:002 IX molL and 0082 p toolL)In vivo result from nude mice bearing hollow fibers with leukemia cells showed that FAB 1 07 inhibited growth of K562 and K562G30 cells in nude miceThe inhibitory effects of FABl07 were in a dose-dependent m
17、anner and 15 U molkg,30 l工molkg and 45 Il molkg on FAB 1 07 had P values less than 00 1,compared witll control groupThe inhibitory activity WaS stronger than that oflmatinib and equal to 368485Flow cytometric assay was perfomed to evaluate the cell cycle and apoptosis Exposure of K562 and K562G30 ce
18、lls to FABl07,Imatinib and 368485 resulted in a11 increase of percentage of apoptofic cellsThe potency of inhibition was stronger than that of Imatinib and equrfl to 368485To investigate the mechanism of FAB 1 07 on the growth inhibition of K562 and K562G30 cells,we tested the effect of FAB1 07 on t
19、he autophosphorylation to Bcr-Abl in K562 and K562G30 cellsFAB 1 07 inhibited autophorylation of Bcr-Abl kinase more effectively than that of lmatimb in both cell lines,and its potency of inhibition Was equal to 368485In conclusion,FAB 1 07,a novel phenylamino pyrimidine class derivative,inhibited g
20、rowth of K562 and K562G30 cells in vitro and in vivo,and the probAble mechanisms Was inhibition on autophosphorylation to Bcr-Abl kinaseThese results suggest thatFAB 1 07 is a promising candidate as a novel therapeutic agem for Imatinib-sensitive andImatinibresistance CMLKey words:chronic myelogenou
21、s leukemia;Imatinib:resistance;phenylamino pyrimidine class derivative7中国医学科学院北京协和医学院博士学位论文刘鹤前言慢性髓性白血病(cllromc myelogenous leukemia,CML)以恶性髓系祖细胞克隆 性增殖为特征,在全世界的年发病率为1-210万人,占成年人白血病的1015, 多发年龄在3555岁之间。CML临床上按病程发展分为慢性期、加速期和急变期三 个阶段。CML的主要病因是由于9号和22号染色体相互易位而形成t(9;22)(q34;q11),细胞遗传学上可见到缩短的22号染色体(Philadel
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