新型Bcr-Abl和SrcAbl抑制剂抗慢性髓性白血病的实验研究教程文件.docx

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中国医学科学院 北京协和医学院 博士学位论文 刘鹤

tetrazolium bromide

OD Optical Density 光密度值

PBS Phosphate Buffered Saline 磷酸盐缓冲液

PCR Polymerase Chain Reaction 聚合酶链式反应

P—gp P-glycoprotein P一糖蛋白

PI Propidium Iodide 碘化丙锭 P13．K Phosphatidylinoskol 3-kinase 磷脂酰肌醇激酶 PMSF Phenylmethylsulfonylfluoride 苯甲基磺酰氟

砌、『笛eA RNA酶A

lU’-PCR 甓e、：erSe n-黜c‘1p‘10n。p01yme勰 逆转录聚合酶链式反应
chaln reactlon

SDS Sodium dodeylsulfate 十二烷基硫酸钠 SDS．PAGE Sds polyacrylamide gel electrophoresis SDS·聚丙烯酰胺凝胶电泳 TAE Tris．CI acetate EDTA buffer TAE缓冲液

TE buffer Tris．C l EDTA buffer TE缓冲液 TEMED N,N,N．N-Tetmmethyl Ethylenediamine 四甲基氨基乙胺
“S Trihydroxymethhylamino methane 三羟甲基氨基甲烷

VCR Vincristine 长春新碱

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第一部分：新型苯胺嘧啶类化合物FABl 07抗慢性髓性白 血病的实验研究

Part I：The activity of FABl07，a novel Bcr—Abl
●_ ■ ·l - l l l ■
inhibitor．against ChronlC myel02enous lenkemla

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摘要

慢性髓性白血病(chrollic myelogenous leukemia，CML)是一种血液系统恶性增 生性疾病。以细胞内出现嵌合蛋白Bcr．Abl为主要特征。Bcr．Abl蛋白具有持续活化 的酪氨酸激酶活性，激活下游多条信号传导通路，引起疾病的发生。

伊马替尼(Imatinib，Gleevec，STI．571)属一种Abl酪氨酸激酶抑制剂，它是 第一个小分子靶向性治疗药物。体内、外实验表明，Imatinib通过抑制Bcr-Abl自 身磷酸化和底物磷酸化，而抑制细胞增殖和诱导凋亡。Imatinib在临床上用于费城 染色体阳性(Philadelphia chromosome positive，Ph+)的CML患者。由于其所产生
的较好血液学和细胞遗传学缓解(尤其是慢性期CML患者)，Imatinib已经作为新
近诊断的CML患者的一线药物。但是Imatinib在治疗CML急变期及ph+的急性淋 巴细胞白血病患者时效果却并不理想，而且随着临床的用药，Imatinib逐渐出现耐 药。因此，这促使人们寻找新的治疗CML和Imatinib耐药的CML的药物。

AMNl07属第二代Abl抑制剂，许多临床前研究结果已经显示出非常好的效果。 研究表明，在许多Bcr．Abl转化的造血细胞系，AMNl07对Bcr-Abl自身磷酸化和 增殖的抑制较Imatinib高20．50倍。而且AMNl07对很多Imatinib耐药的Bcr．Abl
蛋白突变株有很强的抑制作用。目前AMNl07正在进行临床试验，但已有些病例出 现AMNl07耐药，其机制是否与Imatinib耐药相同还在进一步研究中，因此Novartis 制药公司又继续研发更强的Abl抑制剂，其中368485就是Novartis制药公司研制 的一种新型此类化合物，其药物活性尚没有相关报道。

本研究就是探讨一种新型苯胺嘧啶类衍生物FABl07在体内、外对CML细胞
系K562细胞和K562耐Imatinib细胞系K562／G3．0的抑制作用。

本研究采用MTT方法观察了FABl07与Imatinib和368485相比较对K562和 K562／G3．0细胞的生长抑制作用。研究结果表明，FABl07抑制K562和K562／G3．0 细胞生长，IC50分别为O．03 la mol／L和0．07 u mol／L。FABl07对2种细胞的抑制作
用强于Imatinib 0c50分别为0．31 la mol／L和6．32la mol／L)，而与368485(IC50分别 为O．02 1．t mol／L和0．082 la mol／L)相当。

裸鼠中空纤维模型实验进一步证实，FABl07可以抑制K562和K562／G3．0细 胞在裸鼠体内的生长。给药7天后，与对照组相比，FABl07的3个剂量组(15 lZ mol／kg、30 lZ mol／kg和45 u mol／kg)在体内对K562及K562／G3．0细胞生长均呈剂
量依赖性的抑制作用(P<0．01)，并且抑制强度强于等摩尔浓度的Imatinib，与等
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主里墨堂型堂堕 !!塞堡塑墨兰堕 竖主堂垡丝茎 型塑 摩尔浓度的368485相当。

流式细胞术结果表明，FABl07可以剂量依赖性地诱导K562和K562／G3．0细
胞凋亡，与等摩尔浓度的368485相当。

为了阐明FABl07对K562和K562／G3．0细胞生长抑制作用的机制，我们检测 了FABl07对K562和K562／G3．0细胞Bcr．Abl蛋白自身磷酸化的抑制作用。FABl07 可以明显抑制K562和K562／G3．0细胞Bcr．Abl蛋白自身磷酸化。其作用优于等摩 尔浓度的Imatinib，与等摩尔浓度的368485相当。

总而言之，新型苯胺嘧啶类衍生物FABl07在体内外可以明显抑制K562和 K562／G3．0细胞的生长，其作用机制可能与抑制Bcr-Abl蛋白自身磷酸化有关。上 述研究提示，FABl07将是治疗Imatinib敏感和耐药的CML的较好候选化合物。
关键词：慢性髓性白血病；伊马替尼；耐药；苯胺嘧啶类衍生物

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Abstract

Cllromc myelogenous leukemia(CML)is a myeloproliferative disorder of hematopoietic stem cells．The pathologic hallmark of this disease is the Philadelphia
chromosome(Ph)．which is seen in>90％of CML patients．The Ph produces Bcr—Abl
fusion protein,which displays constitutive tyrosine kinase activity and activates several signaling transduction pathways．

The 2-phenylamino-pyrimidine derivative Imatinib(Gleevec，STl571)Was developed as the first molecularly targeted therapy that specifically inhibits the Bcr-Abl tyrosine kinase activity in patients with Ph positive(Ph3 CML．Imatinib acts by revoking the effects of the Bcr-Abl oncoprotein through inhibition of Bcr-Abl
autophosphorylation，inhibition of proliferation,and induction of apoptosis．Due to its excellent hematologic and cytogenetic responses，particularly in patients with cllromc phase CML，Imatinib has moved towards first-line treatment for newly diagnosed CML． However，reponses to Imatinib in patiems with more advanced disease are generally transient．Nevertheless，resistance to the drug has been frequently reported．As a result，a
variety of strategies derived from structural studies of the Abl-Imatinib complex have
been developed，resulting in the design of novel Abl inhibitors．

Several preclinical studies have shown promising results for second generation Abl inhibitor AMN 1 07．Using numerous Bcr-Abl tranformed hematopoietic cell lines， AMN1 07 Was found to be 20—50 fold more potent compared with Imatinib in reduction of both autophosphorylation and proliferation．Nevertheless，cell lines expressing the Imatinib—resistant Bcr-Abl mutants can be inhibited by AMN1 07．AMN1 07 has made its way into clinical trial．Unfortunately，resistance to AMN 1 07 reduced inhibition of cell growth．The molecular mechanisms underlying resistance still need to be determined．

In this study，we investigated the activity of a novel phenylamino pyrimidine derivative FAB 1 07，compared with Imatinib and 368485，in both K562 and K562／G3．0 eelIs．

Effects of FAB 1 07 on the growth of K562 and K562／G3．0 cells were analyzed by MTT assay．The growth of K562 and K562／G3．0 cells Was inhibited by FAB 1 07、航t11 the IC50 value of 0．03 U mol／L and 0．07 II mol／L。respectively．The inhibition Was stronger

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than that of Imatinib(ICs0：O．3 1 IX mol／L and 6．32 IX mol／L)and equal to 368485(IC50：
0．02 IX mol／L and 0．082 p tool／L)．

In vivo result from nude mice bearing hollow fibers with leukemia cells showed that FAB 1 07 inhibited growth of K562 and K562／G3．0 cells in nude mice．The inhibitory effects of FABl07 were in a dose-dependent manner and 15 U mol／kg，30 l工mol／kg and 45 Il mol／kg on FAB 1 07 had P values less than 0．0 1，compared witll control group．The inhibitory activity WaS stronger than that oflmatinib and equal to 368485．

Flow cytometric assay was perfomed to evaluate the cell cycle and apoptosis． Exposure of K562 and K562／G3．0 cells to FABl07，Imatinib and 368485 resulted in a11 increase of percentage of apoptofic cells．The potency of inhibition was stronger than that of Imatinib and equrfl to 368485．
To investigate the mechanism of FAB 1 07 on the growth inhibition of K562 and K562／G3．0 cells，we tested the effect of FAB1 07 on the autophosphorylation to Bcr-Abl in K562 and K562／G3．0 cells．FAB 1 07 inhibited autophorylation of Bcr-Abl kinase more effectively than that of lmatimb in both cell lines，and its potency of inhibition Was equal to 368485．

In conclusion,FAB 1 07，a novel phenylamino pyrimidine class derivative，inhibited growth of K562 and K562／G3．0 cells in vitro and in vivo，and the probAble mechanisms Was inhibition on autophosphorylation to Bcr-Abl kinase．These results suggest that
FAB 1 07 is a promising candidate as a novel therapeutic agem for Imatinib-sensitive and
Imatinib—resistance CML．

Key words：chronic myelogenous leukemia；Imatinib：resistance；phenylamino pyrimidine class derivative

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前言

慢性髓性白血病(cllromc myelogenous leukemia，CML)以恶性髓系祖细胞克隆 性增殖为特征，在全世界的年发病率为1-2／10万人，占成年人白血病的10．15％， 多发年龄在35．55岁之间。CML临床上按病程发展分为慢性期、加速期和急变期三 个阶段。CML的主要病因是由于9号和22号染色体相互易位而形成
t(9；22)(q34；q11)，细胞遗传学上可见到缩短的22号染色体(Philadelpllia[Ph】 cllromosome)，其编码一种异常蛋白质“Bcr．Abl"。由于9号染色体bcr基因断裂
B*AM
点不同，产生三种融合基因，编码三种不同分子量的融合蛋白p190 Bcr-Abl、p210
和p230 B*Abl，其中p210 B。卜Abl过表达足以导致CML发生11I。Bcr-Abl融合基因编码 的Bcr-Abl蛋白为胞浆蛋白，具有持续活化的酪氨酸激酶活性，导致自身酪氨酸残 基磷酸化及许多重要的底物蛋白磷酸化，从而激活多条信号转导途径，使细胞转化、 增殖、分化和凋亡受阻。Bcr．Abl能激活许多信号转导途径和下游的靶点，如MAPK 途径、P13K途径、J刖时STAT途径及STATs途径，其中最主要的是MAPK途径。

肿瘤的发生与多种癌基因的异常激活有关12I。临床上，有95％的CML患者和
30％．50％的急性淋巴细胞性白血病(acute lymphoblastic leukemia,ALL)患者表达 p210脚Abl融合蛋白。分子靶向抗肿瘤药物的设计常常是以这些癌基因为靶点，作 为抗癌药物作用靶点的癌基因在这种肿瘤的发生、发展中具有举足轻重的作用，针
对这些特异性分子部位研制新药是近年来癌症治疗的方向。

伊马替尼(Gleevec固／Glivec@，!matinib，STl571)是苯胺嘧啶类衍生物，属一种Abl 酪氨酸激酶抑制剂，以Abl蛋白激酶的ATP结合位点为基础而设计合成。Imatinib 与Bcr-Abl的非激活形式结合而不是占据整个ATP结合位点。Imatinib通过抑制 Bcr-Abl自身磷酸化和底物磷酸化，而抑制细胞增殖和诱导凋亡13i。Imatinib对其他 的酪氨酸激酶家族PDGFRA／B和c-Kit亦有抑制作用141。Imatinib对Ph阳性 (Philadelphia cllromosome．positive，ph+)的慢性期、加速期和急变期CML均有效 l”l。但是Imatinib在治疗CML急变期及ph+急性淋巴细胞白血病(Philadelphia
chromosome．positive acute lymphocytic leukemia，ph+ALL)患者时效果却并不理想，
有效率为50％．70％，而且随着临床的用药，Imatinib逐渐出现耐药，约有60％的CML
急变期患者及几乎所有的ALL患者在治疗后数周或数月内复发18l。

关于体内19-11l和体外f9．13l原发性或继发性Imatinib抵抗的机制十分复杂，现在还
没有一致的研究结果。到目前为止，主要的耐药机制为：Bcr-Abl激酶扩增或突变ll训，

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生里墨堂型堂堕 j!塞堡塑垦兰堕 堡主兰垡堡奎 型塑
导致Imatinib作用下降或丧失；P糖蛋白的表达，使细胞内药物浓度下掣15l；血浆
蛋白结合‘16l；其他激酶和第二信使的激活，如Src家族‘17I。体外118i和临床113J91试验 表明，增加药物浓度可以克服一些机制的Imatinib耐药。这些数据也对寻找更有效 的治疗CML的Bcr-Abl激酶抑制剂提供有力依据【20I。

AMNl07属第二代Abl抑制剂，由Novartis制药公司研制，许多临床前研究结 果已经显示出非常好的效果。生物结构学研究表明AMNl07结合于Abl蛋白的非激 活构象。研究表明，在许多Bcr．Abl转化的造血细胞系，AMNl07对Bcr．Abl自身 磷酸化和增殖的抑制较Imatinib强20．50倍121I。这是由于AMNl07的晶体结构能更 紧密地与Abl结合。此外，AMNl07在体外能够抑制野生型和多种Imatinib耐药的
Bcr．Abl蛋白突变型(如M351T、F317L和E255V型)，但对T315E和G250E型
Bcr．Abl突变无影响12捌。与Imatinib相似的是，AMNl07也抑制酪氨酸蛋白激酶 PDGFRA、PDGFRB和c．Kit，但对Abl的效果更好。目前AMNl07正在进行临床 试验，同时研究与Imatinib合用的疗效。但已有些病历出现AMNl07耐药，其机制 是否与Imatinib耐药相同还在进一步研究中，因此Novartis制药公司又继续研发更 强的Abl抑制剂，其中368485就是Novartis制药公司研制的一种新型此类化合物， 其药物活性尚没有相关报道。

FABl07是由本所化学合成室冯志强副研究员定向合成的新型Bcr-Abl抑制剂， 其亦属苯胺嘧啶类衍生物。本文观察了FABl07与Imatinib和368485相比对Ph+ CML细胞系及其耐药株的抑制活性。我们还通过裸鼠中空纤维模型观察了FABl07 在体内对这些细胞生长的抑制作用。

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实验材料
一、药品和试剂

l、药品

Imatinib、368485和FABl07均由本所冯志强副研究员合成；368485为白色粉 末，难溶于水，分子量为529，纯度为98％；FABl07为白色粉末，难溶于水，分 子量为630，纯度为98．8％，体外实验用DMSO配制，体内实验以O．5％羧甲基纤维 素悬浮。

2、生化试剂

RPMI 1640培养基购自Gibco公司，胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有 限公司。溴化四氮唑蓝[3-(4，5一dimethylthiazol-2-y1)-2，5一diphenyl-tetrazolium Bromide， MTT】、十二烷基磺酸钠(Sodiumdodeylsulfate，SDS)、过硫酸铵(ammonium persulfate， APS)、聚丙烯酰胺(Acrylamide)、牛血清白蛋(Bovine Serum Albumin，BSA)、 Tween20、溴化乙锭(Ethidium Bromide，EB)、苯甲基磺酰氟(Phenylmethyl Sulfonyl Fluoride，PMSF)、甘氨酸均(Glycine)为Sigma公司进口。二硫苏糖醇(1，4一dithiothreitol， DTT)购于B．M公司，四甲基乙二胺(N，N，N’，N’tetramethylethylenediamine，TEMED) 购自Gibco公司，NP一40(nonidet P．40)、考马斯亮蓝G250、甲叉双丙烯酰胺 (N，N'-Methylen—bis-Acrylamide)购自Fluka公司。三羟甲基氨基甲烷(Tris)为Angus 公司进口产品。AnnexinV．FITC凋亡检测试剂盒购自北京宝赛试剂有限公司。三氯
乙酸(TCA)、碳酸氢钠(NaHC03)为北京化学试剂公司产品。乙二胺四乙酸钠 (EDTA)、二甲基亚砜(DMSO)由北京化工厂生产。溴酚兰由上海试剂三厂提 供。其它常规试剂及溶剂均由北京化工厂、北京双环化学试剂厂及北京化学试剂研
究所提供。phosphor-c—Abl(Tyr245；rabbit polyclonal)，Cell signaling公司产品；C·Abl (mouse polyclonal)为Santa Cruz Biotechnology公司产品；辣根过氧化物酶偶联的 各种二抗购自北京中衫生物技术有限公司。

二、细胞株

人CML细胞系K562；K562耐Imatinib细胞系(简称K562／G3．0)，由本实 验室传代并保种。

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三、实验动物

Balb／c Nu裸鼠，雌性，体重18-229，由中国医学科学院实验动物研究所动物 繁育场提供。合格证号：SCXK京2006．0001。

四、主要仪器
NAPC05420．I型及SANYO MC0175型C02培养箱，NAPCO公司；
JJT．900／1300超净工作台，北京半导体设备一厂；Olympus IX70倒置显微镜，日本 Olympus公司；TGL．16G冷冻离心机、常温离心机，上海安亭科学仪器厂；3．18K 离心机，Sigma公司； Adventurer万分之一电子天平，OHAUS公司；Millipore纯
水仪，Millipore公司；WELLSCAN MK 3型酶标仪，LABSYSTEMS DRAGON公
司；Beckman LS．9800型液闪计数仪；旋涡混合器，美国Bohemia N．Y公司；EPS601 型电泳仪，Amersham Biosciences公司；ECP3000三恒电泳仪及DYYHI．40C型电 转仪，北京六一仪器厂；水平电泳槽，北京东方仪器厂；垂直电泳槽，北京六一仪 器厂；垂直电泳槽，Amersham Biosciences公司；DSHZ．300多用途水浴恒温震荡器， 江苏太仓实验仪器厂；HY4型调速多用震荡器，常州国华电器有限公司；LX．100 手掌型离心机，江苏海门市麒麟医用仪器厂；WZ．2A型微量震荡器，北京海淀电子 医疗仪器厂；AP48 chamber、PVPF聚碳酯膜(8p,m，25×80mm)，Neuro Probe 公司；Genius PSl 15型PCR仪，Techne公司；UV．260型紫外．可见分光光度计，
Shimadza公司；Transilluminator UV／white 2020D，Cold Springs及Kodakl20凝胶成 像系统；C-4040ZOOM型Olympus数码相机，Olympus公司。

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实验方法

一、细胞培养

实验所用K562细胞及K562耐Imatinib细胞(K562／G3．O)培养在含10％灭活 胎牛血清的RPMll640培养基中，37"C，5％C02孵育箱，按规定方法培养，取处于 对数生长期的细胞用于实验。其中K562／G3．0细胞培养于含3 1．t mol／L Imatinib的培 养液中，实验前用新鲜无药培养液传代3次。
二、MTT法测定肿瘤细胞存活率

将对数生长期的细胞离心后配制成浓度为l×105细胞_yml的细胞悬液，按10000 个／孔接种于96孔板，每孔加100I-tl，加入含不同浓度药物及相应溶剂对照的新鲜培 养基，每孔加100I-tl(DMSO终浓度<0．1％)，每组设三个平行孔，于37"C培养3 天后，每孔加20山新鲜配制的含5mg／ml MTT的无血清培养基，继续培养4小时， 离心，弃上清，每孔加2009l DMSO溶解MTT甲簪沉淀，用微型振荡器振荡混匀，
用M硒型酶标仪在参考波长450nm，检测波长570nm条件下测定光密度值(0D)，
以溶剂对照处理的肿瘤细胞为对照组，用下面公式计算药物对肿瘤细胞的生存率， 并按中效方程计算IC50：
生存率(％)=给药组平均OD值／对照组平均OD值×100％

三、流式细胞术检测细胞凋亡率

收集细胞，离心后去上清，PBS洗涤一次。将细胞弹开，每管加70％乙醇约2ml

固定，40C过夜。次日1,000rpm离心5分钟，去乙醇，PBS洗涤2次，1,000rpm离 心5分钟，重复离心洗涤两次。弃上清，保留约0．1ml液体。加RNase A 50山(终 浓度为60I-tg／m1)，涡旋，37。C温育30分钟。加PI(碘化丙啶)(终浓度为50pg／m1)
至0．5ml，摇匀，40C避光，作用60分钟。经尼龙网过滤，在流式细胞仪上测定细
胞各期DNA含量并进行细胞周期分析。

四、Western Blot法分析蛋白表达【23l

1,500rpm离心5分钟收集细胞，冷PBS洗两次，加入5009l细胞裂解液(含 25mmol／L Tris-HCl，1 50mmol／L NaCl，5mmol／L EGTA，5mmol／L EDTA，1 0mmol／L NaF，lmmol／L PMSF，1％TritonX一100，0．5％Nonidet P40，10,g／rm Aprotinin,10 pg／ml Leupeptin)，置冰浴中裂解30分钟，4℃，12，0009离心15分钟，收集上清 液。采用Brandford法测定蛋白浓度。
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生垦墨堂型兰堕 !!室垫塑垦兰堕 堡主兰垡丝奎 型塑 配制5％的浓缩胶及6％或12％的分离胶。各取含相同蛋白浓度的细胞裂解上清
液与5xSDS上样缓冲液(250mmol／L Tris．HCl，pH6．8，10％SDS，500mmol／L DTT (用前加)，50％甘油，0．5％溴酚兰)混合后，100"C水浴煮沸5分钟。冷却后上样， 80V电泳。待样品前沿进入分离胶后，调电压至110V，继续电泳约2小时。电泳 结束后剥离凝胶，以去离子水漂洗。切6层Whatman 3MM滤纸及一张Hybond．C 硝酸纤维素膜(Amersham LIFE SCIENCE)，大小与凝胶相同，滤纸和硝酸纤维素
膜分别在电转缓冲液(39mmol／L甘氨酸，48mmol／L Tris，0．037％SDS，20％甲醇) 和去离子水中浸泡5分钟。用半干电转法转膜，在阳极与阴极间依次放置3层滤纸、 硝酸纤维素膜、凝胶、3层滤纸，转膜电流为0．65mA／cm2，2小时。电转后的硝酸 纤维素膜用丽春红S染液(3％丽春红，30％TCA，30％5．磺基水杨酸)染色1分钟， 待蛋白条带显出后，水洗，观察电转移效率，标记标准蛋白条带的位置。硝酸纤维 素膜以含有3％BSA的1vrBS(0．1％Tween．20；10mmol／L Tris．C1，pH7．5；150mmol／L
NaCl)4"C封闭非特异结合位点过夜。用上述TTBS液洗膜，10分钟／次×3次。将膜
与稀释的一抗(用TTBS液按1：500稀释第一抗体)室温孵育3小时，TTBS液洗 膜，10分钟／次×3次。将膜移入二抗工作液(用TTBS液按1：1000稀释辣根过氧 化物酶标记的二抗)，室温反应2小时。TTBS液洗膜，10分钟／次×3次。加入辣
根过氧化物酶酶HRP．ECL发光液进行蛋白定性半定量分析。将膜平放，滴加发光

液(威格拉斯)，FuJifilm(Japan)化学发光仪呈像，经Western．blot分析软件
(gelPr032)测出条带的光密度值分析。
五、体内药效．中空纤维法【24l

PVDF中空纤维浸入充满含20％胎牛血清的RPMll640中，37℃平衡至少12 小时，将处理好的纤维段在冰冷的含20％的RPMll640中冷却；无菌条件下收集 K562及K562／G3．O细胞，用无血清培养基调整细胞浓度至1×10‘7个／ml，将已经制 备好的细胞悬液通过lml注射器(4号针头)注入中空纤维中，然后用平头持针器 进行热封，随后用加热后的持针器先将纤维段分成若干小段，每段约为l一2cm， 剪断后将各小段放入盛有完全培养基的平皿中，37。C，5％C02，孵育过夜。次日将 准备好的纤维接种于裸鼠背部皮下。于接种后第二天给裸鼠灌胃给药，每天一次， 连续7天。7天后，取出纤维，置于37℃预热的培养基平衡30min，随后置于lmg／ml MTT(培养基配制，并于37℃预热)，37℃，4小时。吸干培养基后，纤维段用含 有2．5％硫酸鱼精蛋白(protamine sulfate)的生理盐水冲洗两遍，并于4。C孵育过夜。
取出纤维段，置于24孔板中，每孔一根，并将其截为两段，干燥过夜。第2天，
每孔加入2509l DMSO提取甲簪，室温下于水平摇床上4小时，然后取150I．tl于96
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孔板中，570rim测吸光度。

六、统计学处理

应用SPSS 13．0统计软件包统计，结果以平均值±标准差(mean+SD)表示，
组间比较采用011e way ANOVA分析。

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实验结果

一、FABl07对K562和K562／G3．0细胞增殖的影响

MTT法观察了FABl07对K562细胞的生长抑制作用，以及不同浓度FABl07 对Imatinib耐药株K562／G3．0细胞生长的抑制作用。与Imatinib相比，FABl07对 K562细胞生长的抑制作用明显优于Imatinib，IC50分别为O．03 Il mol／L和0．31 u mol／L，FABl07比Imatinib强10倍，与368485抑制强度相当(IC50为0．02 p mol／L)。 不仅如此，FABl07还表现出明显地抑制Imatinib耐药株K562／G3．0细胞增殖的作 用。FABl07作用于K562／G3．0细胞的IC50为O．07 la mol／L，而Imatinib为6．32|l mol／L，FABl07是I