第一法大肠菌群MPN-计数教学资料.doc

第一法大肠菌群MPN 计数

精品资料
第一法大肠菌群MPN 计数

操作步骤
6.1、样品的稀释
6.1.1、 固体和半固体样品：称取25g 样品，放人盛有225ml磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8 00or/min-10 000r/min 均质1 min-2 min ，或放人盛有225ml磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1 min-2 min ，制成1:10 的样品匀液。
6.1.2、 液体样品：以无菌吸管吸取25ml样品，置盛有225ml磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分棍匀，制成1:10 的样品匀液。
6.1.3、 样品匀液的pH 值应在6.5-7.5 之间，必要时分别用1mol/L 氢氧化钠（NaOH ）或1 mol/L 盐酸（HCI ）调节。
6.1.4、 用1ml无菌吸管或微量移液器吸取1:10 样品匀液1ml，沿管壁缓缓注人9ml磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1 支1ml无菌吸管反复吹打，使其混合均匀，制成1:100 的样品匀液。
6.1.5、 根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成10 倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1 次，换用1 支1ml无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15 min 。
6.2、 初发酵试验
每个样品，选择3 个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3 管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1ml（如接种量超过1ml，则用双料LST肉汤）, 36℃±1℃ 培养24h±Zh ，观察倒管内是否有气泡产生，如未产气则继续培养至48h±2h 。记录在24h 和48h 内产气的LST 肉汤管数。未产气者为大肠菌群阴性，产气者则进行复发酵试验。
6.3、 复发酵试验
用接种环从所有48h±2h 内发酵产气的LST 肉汤管中分别取培养物l环，移种于煌绿乳糖胆盐( BGLB）肉汤管中，36℃±1℃ 培养48h±2h ，观察产气情况。产气者，计为大肠菌群阳性管。
6.4、 大肠菌群最可能数（MPN ）的报告
根据大肠菌群阳性管数，检索MPN 表（见附录B ) ，报告每克（或毫升）样品中大肠菌群的MPN 值。
第二法大肠菌群平板计数

8、 操作步骤
8.1、 样品的稀释
按6.1 进行。
8.2、 平板计数
8.2.1、 选取2 个～3 个适宜的连续稀释度，每个稀释度接种两个无菌平皿，每皿1ml。同时分别取1ml生理盐水加人两个无菌平皿作空白对照。
8.2.2、 及时将15 mL-20ml冷至46℃ 的结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA ）约倾注于每个平皿中。小心旋转平皿，将培养基与样液充分混匀，待琼脂凝固后，再加3 mL-4mlVRBA 覆盖平板表层。翻转平板，置于36℃±l℃ 培养18h-24h 。
8.3、 平板菌落数的选择
选取菌落数在30-150 之间的平板，分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为0.5 mm 或更大。
8.4、 证实试验
从VRBA 平板上挑取10 个不同类型的典型和可疑菌落，分别移种于BGLB 肉汤管内，36℃±1℃ 培养24h-48h ，观察产气情况。凡BGLB 肉汤管产气，即可报告为大肠菌群阳性。
8.5 、大肠菌群平板计数的报告
经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以8.3 中计数的平板菌落数，再乘以稀释倍数，即为每克（或毫升）样品中大肠菌群数。
第三法大肠菌群PetrifilmTM 测试片法

10、 操作步骤 10.1 样品的稀释
按6.1 进行。
10.2、 测定
10.2.1、 样品接种及培养
将待检样品选取2 个-3 个适宜的连续稀释度，每个稀释度接种两张测试片。将PetrifilmTM 大肠菌群测试片置于平坦实验台面，揭开上层膜，用吸管吸取1ml样液垂直滴加在测试片的中央，将上层膜缓慢盖下，避免气泡产生和上层膜直接落下。把压板（平面底朝下）放置在上层膜中央，轻轻地压下，使样液均匀覆盖于圆形的培养面积上，切勿扭转压板。拿起压板，静置至少1 min 以使培养基凝固。将测试片的透明面朝上置于培养箱内，堆叠片数不超过20片，36℃±1℃ 培养24h±2h 。
10.2.2、 判读
培养24h±Zh 后应立即计数，可目测或用标准菌落计数器、放大镜或PetrifilmTM 自动判读仪来计数。红色有气泡的菌落确认为大肠菌群。圆形培养区边缘上及边缘以外的菌落不作计数。当培养区域出现大量气泡，大量不明显小菌落或培养区呈暗红色三种情况，表明大肠菌群的浓度较高，需要进一步稀释样品以获得更准确的读数。
10.3、 大肠菌群测试片计数的报告
选取菌落数在15-150 之间的测试片，计数其红色有气泡的菌落数，两个测试片的平均菌落数乘以稀释倍数即为每克（或毫升）样品中的大肠菌群菌落形成单位（CFU ）数。如果所有稀释度测试片上的菌落数都小于15 ，则计数稀释度最低的测试片上的平均菌落数乘以稀释倍数报告；如果所有稀释度的测试片上均无菌落生长，则以小于1 乘以最低稀释倍数报告；如果最高稀释度的菌落数大于150 ，计数最高稀释度的测试片上的平均菌落数乘以稀释倍数报告。计数菌落数大于150 的测试片时，可计数一个或两个具有代表性的方格内的菌落数，换算成单个方格内的菌落数后乘以20 即为测试片上估算的菌落数（圆形生长面积为20cm2 , ）。报告单位以CFU/g （或CFU/mL ）表示。

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