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人的外周血淋巴细胞培养知识分享.doc
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1、人的外周血淋巴细胞培养学习好资料人的外周血淋巴细胞培养 摘 要 淋巴细胞是免疫系统中最重要的细胞,在免疫中起关键作用,维持内环境的稳定。对人的外周血淋巴细胞进行染色体核型分析对人类遗传研究及临床应用有重大意义。每一物种都有一定数目及一定形态结构的染色体,可在显微镜下观察到。本次实验的目的就是掌握人体微量血液体外培养制备染色体标本的方法并学习对人的外周血淋巴细胞进行核型分析。每1ml 外周血中一般含有约13106个小淋巴细胞, 几乎都处于G1期或G0期的非增殖状态 ,一般情况下是不再分裂的。但当在培养液中加入植物凝血素(PHA)后,淋巴细胞受刺激便转化为淋巴母细胞,重新进入增殖周期,进行有丝分裂
2、。经过6672小时(三个周期)的短期培养,秋水仙素的处理,低渗和固定,就可获得大量的有丝分裂相细胞,从而进行染色体标本制备和核型分析。这种微量全血培养技术已在临床医学、病毒学、药理学、遗传毒理学等方面得到了广泛应用。本实验采取了人类的外周血进行实验,经各种技术处理后最后得到较为清晰的人体染色体照片。 通过实验发现:人类每个体细胞有46条染色体,22对常染色体和一对性染色体,男性是46,XY;女性是46,XX。 根据染色体的形态、大小、及着丝粒的位置,将人的外周淋巴细胞的46条染色体分为A、B、C、D、E、F、G7组共23种类型。 关键词 人的外周血淋巴细胞 染色体 低渗溶液 核型分析 秋水仙素
3、 动物细胞体外培养 Human Peripheral Blood Lymphocyte Culture Abstract: Lymphocytes are among the most important immune system cells in the immune plays a key role in together, in order to maintain a stable environment. To analyze chromosome of lymphocytes is very important. Various biological chromosome numb
4、er and shape are constant,can be seen under a microscope. The purpose of this experiment is human body trace blood samples were cultured in vitro chromosome preparation methods and studying on the peripheral blood lymphocyte karyotype analysis on.In human bodys 1ml circumference blood includes appro
5、ximately 13106 the small lymphocyte generally, usually they are between time G0 and the G1 time, generally is not divided. But when adding plant in medium coagulopathy (PHA), lymphocyte transformation and stimulated for lymphatic mother cell proliferation capacity, make its recovery, then entering m
6、itosis. After 6672 hours(three cycles) short-term training, autumn grain processing, daffodil, low permeability and fixed can be gained lots of mitotic cells, for makes the chromosome specimen preparation and analysis. This kind of micro whole blood culture technique in aspects and so on clinical me
7、dicine, virology, Pharmacology, heredity toxicology obtained widespread application.The experimental taken to conduct experiments on human peripheral blood, the various technical ultimately be treated more clear picture of human chromosomes. Through the experiments have found that each human somatic
8、 chromosome, 22 to 46 euchromosome sex chromosomes, and a pair of 46 XY; male is, Women are 46, XX. This method has been clinical medicine and virology, pharmacology, genetic toxicology etc widely. According to the chromosomes of the shape, size, and the centromere position, the peripheral lymphocyt
9、es 46 chromosomes into A, B, C, D, E, F, the G7 group of 23 types.Key words: Human blood lymphocytes Chromosome Low permeability solution Karyotype analysis Autumn daffodils element zooblast in vitro raise offcenter前 言 细胞培养技术是目前生命科学研究领域的一项常用而重要的技术,它涉及的技术有:无菌操作技术、细胞分离技术、细胞培养技术、显微摄影技术、图像分析技术等。Moorhead
10、和Levan等(1960)建立的人体外周血淋巴细胞培养技术,以及Rothrels等(1958)建立的气干法制片技术,成了研究人与哺乳类染色体的最主要技术。这种取材简易、用血量少的培养方法已被临床医学、病毒学、药理学,遗传毒理学等方面广泛采用。细胞培养是一种程序复杂而又要求十分严谨的实验技术。要使细胞在体外长期生存,必须模拟体内环境,共给细胞存活所必需的条件。如供给适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖以及有关的生长因子;氧气及适宜的温度;注意调节其外环境的酸碱度(pH)与渗透压;以及为排除细胞代谢产物的危害,保持良好适宜的外环境而进行必需的传代等等。所有这一切条件与操作都要保持在无菌条件下进
11、行。人们对许多动植物的染色体进行广泛研究【1】,并取得了可喜成果,可对哺乳动物及人类染色体研究进展不大。其原因在于:1)不易获得分裂过程中的细胞;2)过去的传统方法多为切片、压片,对描述染色体结构不准确,技术不高;3)人类染色体数目多,大小不同,彼此重叠。1912年,Warfter 最先研究人类染色体。1923年,报道人类染色体的二倍体为48条。1956年,J.H.Tjio A.Levan 培养人胚组织细胞,计数人体细胞染色体数为46条。1960年,Moorhead建立人体外周血培养技术,使染色体的研究跃进一步。1968年,T.U. Casperssan提出染色体显带技术。自1956年Tjio
12、(庄有兴)和Levan确定人类染色体数目为46个后,在1960年的Denver会议和1963年的London会议制定了统一的人类染色体命名体制:按照染色体的相对长度、臂比和着丝粒指数,将常染色体(22对)按大小用阿拉伯数字标记,顺次排列为122号,性染色体用X和Y标记;并按染色体大小和着丝粒位置,把人类染色体分为七个组,用大写字母AG表示,把人的46个染色体分为7个群【2】。但对识别每一个染色体仍有很大困难,尤以C组更难区别。1970年,发现染色体分化染色,并于1971年召开了国际性巴黎会议,为G、Q、C和R带四种分带技术建立了命名法。以后又逐步建立了Giemsa11分化染色法及染色体脆性位点
13、显示法。为染色体遗传病诊断、杂种细胞检定、特殊细胞株标记、染色体的识别等开创了一系列检测方法,大大加速了染色体研究的进展。 细胞遗传学组织培养技术为人类染色体的研究提供了条件。技术突破主要在于【3】4:1)人体外周血淋巴细胞培养和PHA的应用。PHA 是从菜豆种子中提取出来的,大量的PHA具有凝血作用。如果适合,可刺激细胞转为母细胞,从而进行有丝分裂。2)秋水仙素的应用。秋水仙素可阻断纺缍体截止于中期,使染色体个体大,结构清晰,缩短适度,细胞质粘度降低。3)低渗处理(水或0.075mlKCl)使红细胞胀破,白细胞胀大,染色体空间变大,易伸展,便于观察。 通过本实验掌握人体外周血离体培养制备染色
14、体标本的方法。人体外周血的形成包括红细胞、白细胞、血小板,其中红细胞和血小板不能离体培养,白细胞中含有小淋巴细胞。 所谓外周血培养即是将外周血接种在适当的培培养物中加入适量的秋水仙素,使纺锤体微管解聚,这样细胞停留在中期,可以获得大量的分裂细胞。外周血淋巴细胞是不能增殖的分化细胞群,在体外无菌培养条件下,若于培养基中植物凝集素(PHA)则可刺激处于G1期或G0期的淋巴细胞转化为淋巴母细胞,重新有丝分裂的能力,经一段时间的培养,秋水仙素的处理 ,低渗和固定, 即可获得大量分裂期细胞以供染色体分析。秋水仙素可通过干扰微管组装而抑制纺锤丝形成,使细胞分裂顺利进入后期而停滞于中期,从而可在短期内积累大
15、量最适于进行染色体分中期分裂相【5】。此外,秋水仙素还能使染色单体缩短、分开,使染色体呈现明显形而利于辨认。本实验中采用体外培养和低渗技术。体外培养的原理是将离体的细胞放入培养基中进行生长繁殖,保持细胞的生命活力,便以对细胞进行各方面的研究。通过许多学者的改进和革新,培养基由天然的动物血浆改为合成培养基,促进细胞生长的物质从胎汁改为动物血清,本实验中用的小牛血清。体外培养技术已经广泛应用在杂交瘤技术制备单克隆抗体,动物细胞的大规模培养,微生物制药技术,基因转染与细胞融合以及细胞转化工程技术等方面。低渗处理的目的是使水分通过细胞膜向细胞内渗入,导致转化的淋巴细胞,染色体进一步分散而利于分析。同时
16、,低渗处理还可使红细胞质膜破裂,经后血影浮于上清中被去除,后续的固定过程主要针对淋巴细胞,改善了淋巴细胞的固定质量及标本质量。1材料1.1 材料 人的外周血淋巴细胞1.2 药品 1.2.1 RPMI1640培养基6,含有20种氨基酸,维生素,生物素,碳水化合物,无机物。1.2.2 肝素,作为抗凝剂使用,主要起抗凝血作用。1.2.3 秋水仙素,作为有丝分裂的阻止剂,它能改变细胞质的粘度,抑制细胞分裂时纺锤体形成,使细胞分裂停留在中期。 1.2.4 植物凝血素(PHA),是淋巴细胞有丝分裂刺激剂,激活细胞分裂 。1.2.5 双抗:青霉素、链霉素为广谱抗生素,杀菌。1.2.6 0.9%生理盐水,维持
17、人的外周血淋巴细胞内环境稳态。1.2.7 固定液,甲醇:冰醋酸=3:1使血清蛋白、核蛋白凝固。1.2.8 姬姆萨染液,Giemsa染色液使染色体染色。1.2.9 0.1mol/L 磷酸缓冲液(pH7.47.6),维持细胞内环境稳态。1.2.10 低渗液:0.075mol/L KCl或蒸馏水。使细胞胀大,染色体铺展,轮廓清晰,染色增强。1.2.11 3.5NaHCO3溶液,调节pH值。1.2.12 小牛血清,促进细胞繁殖和维持pH值。1.3 药品的配制RPMI“1640”培养基:称取“1640”粉末1.05克,用100ml的蒸馏水溶解,加入NaHCO3 0.11克,吹CO2气体校正pH至7.2。
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