感受态细胞讲解学习.doc

感受态细胞精品资料1感受态细胞：细菌处于 0，CaCl2 的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的 DNA 形成抗DNase 的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经 42短时间热冲击处理，促使细胞吸收 DNA 复合物。钙离子的作用是结合于细胞膜上，是细胞膜呈现一种液晶态。在冷热变化刺激下液晶态的细胞膜表面会产生裂隙，使外源DNA进入。所谓的感受态，即指受体（或者宿主）最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态，它是由受体菌的遗传性状所决定的，同时也受菌龄、外界环境因子的影响。将快速生长中的大肠杆菌（对数生长期）置于经低温预处理的低渗氯化钙溶液中，便会造成细胞膨胀（形成原生质球），使细菌处于容易吸收外源DNA的状态。感受态细胞):受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl，RuCl等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许多有外源DNA的载体分子通过的感受态细胞。2分子克隆中重组体筛选和鉴定的原理方法：重组克隆的初步筛选克隆的筛选可以根据载体类型、受体细胞特性的变化、外源DNA分子本身的特性，采用不同的方法。主要有遗传学检测、物理特性检测、分子杂交以及免疫学分析等。从初步筛选直到分子杂交，进一步到DNA测序和基于蛋白质功能的分析，使得对克隆的检测逐步深入、精确。.1 重组克隆的遗传学检测遗传学检测方法是重组子筛选过程中最初的检测步骤。重组子的表征来源于载体所携带的标记和重组子结构特性。根据这两类表征对重组子进行初步筛选。(1) 抗药性筛选这是利用载体DNA上组装的抗药性选择标记进行筛选的方法。常用的抗生素筛选剂:氨苄青霉素（ampicillin，Ap或Amp）；氯霉素（chloramphenicol，Cm或Cmp）；卡那霉素（kanamycin，Kn或Kan）；四环素（tetracymic，Tc或Tet）；链霉素（2） 插入失活筛选法检测克隆载体携带有外源DNA的通常方法是插入失活。经过抗药性筛选获得的大量转化子中既包含所需要的重组子，也包含非重组子。为了进一步筛选出重组子，可利用质粒载体的抗药性进行再次筛选。（3） 插入表达筛选法与插入失活相反，插入表达法是外源目的基因插入特定载体后，能激活用于筛选操作的标记基因的表达，由此进行转化子的筛选。设计载体时，在筛选标记基因前面连接一段具有抑制作用的负调控序列，插入外源DNA将使该负调控序列失活，其下游的筛选标记基因才能表达。（4） 环丝氨酸筛选这种筛选方法只使用于抗四环素的基因插入失活的重组克隆筛选。（5） 显色反应筛选法上面所述的抗药性等筛选法是用插入失活原理筛选重组DNA的方法。对菌落或噬菌斑平板进行影印复制，通过两个平板的比较，才能辨别插入失活的表型特征。这给筛选工作带来许多麻烦。显色反应可以在平板上或膜上直接显示出重组克隆，不仅方便而且灵敏2. 报告基因报告基因是某种生物的特定基因，装配在载体上成为载体结构的一部分，具有指示的功能。与抗药性基因相比较，报告基因作为筛选方法有更高的灵敏度和准确性，在基因工程中的重要性要大得多。3. 依赖于重组子结构特征分析的筛选方法（1）快速裂解菌落鉴定分子大小 根据有外源DNA片段插入的重组质粒与载体DNA之间大小的差异来区分重组子和非重组子 （2）限制性核酸内切酶酶解分析法不仅可以进一步筛选鉴定重组子，而且能判断外源DNA片段的插人方向及分子质量大小等 将重组DNA分子限制酶切点图谱与空载体图谱作对比，根据各种酶切所得DNA片段的大小及变化，即可推测有无外源DNA的插入，并确定出各插入片段的相对位置。 （3）利用PCR方法筛选确定重组子利用合适的引物，以从初选出来的阳性克隆中提取的质粒为模板进行PCR反应，通过对PCR产物的电泳分析来确定目的基因是否重组入载体中。（4）DNA序列测定 最后为了确证目的基因序列的正确性，必须对重组体的DNA进行序列测定。4. 物理检测法凝胶电泳检测法质粒DNA的电泳迁移率是与其分子量大小成比例的。因此，那些带有外源DNA插入序列的分子量较大的重组体DNA，在凝胶中的迁移速度，就要比不具有外源DNA插入序列的分子量较小的质粒DNA来得缓慢些根据这种差别，就可以容易地鉴定出哪些菌落是含有具外源NDA插入序列的分子量较大的重组质粒（二） 目的克隆的鉴定经过初步筛选获得的阳性克隆，下一步必须对带有目的序列的克隆做进一步筛选和鉴定。鉴定一般有几种常用方法：（1）分子杂交；（2）免疫学检测；（3）DNA测序；（4）蛋白质活性筛选；（5）基因互补实验。1. 分子杂交核酸分子杂交有多种方法：原位杂交、点杂交及Southern杂交等。原理：带有互补的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA，当它们混合在一起时，其相应的同源区段将会退火形成双链的结构。如果彼此退火的核酸来自不同的生物有机体，那么如此形成的双链分子就叫做杂种核酸分子。能够杂交形成杂种分子的不同来源的DNA分子其亲缘关系较为密切；反之，其亲缘关系则比较疏远。2. 免疫学检测免疫学检测的前体是需要有目的蛋白质，一般从纯化的蛋白质制备抗体。原理：是细胞因子（或受体）与相应的特异性抗体（单克隆抗体或多克隆抗体）结合，通过同位素、荧光或酶等标记技术加以放大和显示，从而定性或定量显示细胞因子（或受体）的水平。3. 蛋白质活性和功能互补筛选DNA杂交和免疫检测对于多数基因和基因产物都是有效的。蛋白质活性作为克隆的指示标记有一定的难度。如果筛选的目的蛋白是一种酶，也可以根据酶对底物的反应来设计克隆的检测。3 原代培养的操作流程：流程：1.组织取材：2.组织细胞的分离：方法有：机械法（离心分离法、切割分离法、机械分离法）消化法（胰蛋白酶消化法、胶原酶消化法、螯合剂消化法）3.培养方法：组织块培养法、单层细胞培养法、悬浮细胞培养法仅供学习与交流，如有侵权请联系网站删除 谢谢5