细胞工程动物组织和细胞培养.doc

第3章

动物细胞和组织培养工程

第一节 植物组织和细胞培养的基础知识

一 动物细胞培养的基本条件

无菌条件：净化工作室，风淋室，传递窗，高效过滤器，

洁净层流罩，生物安全柜，超净工作台，紫外

灯，电热干燥箱，高压灭菌器，抗生素

细胞生长条件：纯水蒸馏器，纯水仪，培养板，培养瓶，

CO2培养箱，培养基，血清

细胞检测条件：倒置显微镜，酶标仪 ，微孔板震荡器，高

速离心机，移液器

细胞保存条件：液氮罐
实验室安全：生物实验室安全，P1,P2,P3实验室安全

(一) 无菌条件

· 净化工作室，风淋室，传递窗，高效过
滤器，洁净层流罩，生物安全柜，超净
工作台，紫外灯，电热干燥箱，高压灭
菌器，抗生素.

1 净化工作室

------ 我国药品生产洁净室（区）空气洁净度标准 -------

洁净度级


尘粒最大允许数/立方米


尘粒最大允许数

别

100

10,000

100,000

300,000

≥0.5um

3,500

350,000

3,500,000

10,500,000

≥5um

0

2,000

20,000

60,000

浮游菌/立方

5

100

500

NA

沉降菌/皿

1

3

10

15

2 风淋室:

●风淋室是生物洁净室
的抱负配套设备，用于
吹除进入洁净厂房的人、
物表面附着的尘埃
●是进行人身、物料净
化和防止室外空气侵入
洁净区的有效设备
●风淋室可以配合加热
器，冬天可以加热，温
度可调，一般控制温度
在30-35℃较为适宜。

3 传递窗:

该装置是一种洁净室

的辅助设备，重要用于

洁净区与洁净区，洁净

区与非洁净区之间小件

物品的传递，以减少洁

净室的开门次数，把对

洁净区的污染减少到最

低限度。

4 高效过滤器:

●高效过滤器是用超细玻璃纤维

纸作滤料，胶板纸作分隔板，可

与铝合金框、木框及镀锌钢板框

组合而成。

●特点：具有低阻高效、轻质、

容尘量大等特点，

●合用于常温常压常湿条件下环

境空气的净化.

5 洁净层流罩:

层流罩是可提供局部高洁净

环境的空气净化设备。洁净

层流罩是将空气经风机以一

定的风压通过高效空气过滤

器后，使洁净空气呈垂直气

流送入工作区，从而保证了

工作区内达成工艺所需的高

洁净度。

6 超净工作台

超净工作台的工作
原理是运用鼓风机
驱动空气通过高效
滤器除去空气中的
尘埃颗粒，使空气
得到净化。净化空
气渐渐通过工作台
面，使工作台内构
成无菌环境。

7 生物安全柜:

一种既能使操作导致无菌、
无尘的局部空气环境，保证检
验、检测不受污染，又能保证
被研究的对象（如病菌、细菌
等）不外溢，保护周边环境及
操作人员的安全隔离设备。
该设备可广泛应用于低、
中档危险度的临床细菌学，病
毒学、微生物学、组织培养、
生物学及生命科学的研究，加
工、检查部门。

· 如何除菌？

· 灭菌

8 紫外灯 ：紫外线消毒。重要用于培养室空气、
操作台、塑料培养皿和培养板等表面消毒 。

9 电热干燥箱：干热消毒（160 ℃ ，2小时）。重要用干玻璃
器皿消毒 。

10蔡氏（ Zeiss）滤器：过滤除菌，滤器中的滤膜
一般用0.2～0.3μm孔径的微 孔滤膜。凡在高温或
射线下易发生变性或失去功能的物质，如人工合
成培养液、血清、消化 用胰酶等都须用滤器过滤
除菌。

滤 器

大容量高压灭菌器

(二) 细胞生长条件

· 纯水蒸馏器，纯水仪，培养板，培养瓶，
CO2培养箱，培养基，血清

1自动双重纯水蒸馏器


2 纯水仪

精滤、活性碳吸附


反渗透

3 标准型细胞培养板 （Tissue Culture Plates）

6孔，12孔，24孔，48孔，96孔

4 培养瓶

5 CO2培养箱

CO2培养箱重要由箱体结构
件、温度控制系统和CO2浓度
控制系统三部分组成。

CO2培养箱设定的条件为37
℃ ，5％CO2 。

再现活体环境对于温度、PH值
CO2浓度、氧分压（O2浓度）、相
对湿度等细胞生长关键的因素，

6 移液器

(三) 细胞检测条件：

· 倒置显微镜，酶标仪 ，微孔板震荡器，
高速离心机，移液器

15

用于微生物、细胞、细菌、组织 培养、悬浮体、沉淀物等
的观测，并可将此过程中的任一形态拍摄下来。

2


酶标仪


3 微孔板震荡器

通过自动酶标仪计数来检测活细胞
数量。


重要用于酶标板、细胞培
养板(如6孔板、12孔板、
24孔板、48孔、96 孔板

等)等溶液的混匀或细胞
的混匀。

(四) 细胞保存条件：

· 液氮罐

-196 ℃

(五) 实验室安全：

· 生物实验室安全，P1,P2,P3实验室安全

实验室安全

层流净化细胞培养室管理规则

一级生物安全防护实验室

二级生物安全防护实验室

三级生物安全防护实验室

四级生物安全防护实验室

层流净化细胞培养室管理规则

局部小环境空气
达成洁净度等级


层流净化细胞培养室的总体要
求：经济、有序、高效、安全。
初步制定相关制度如下：

实验室安全级别

一级生物安全防护实验室

实验室结构和设施、安全操作规程、安全设备合用于

对健康成年人已知无致病作用的微生物，如用于教学

的普通微生物实验室等。

二级生物安全防护实验室

实验室结构和设施、安全操作规程、

安全设备合用于对人或环境具有中档

潜在危害的微生物。

二级生物安全防护实验室

1 也许产生致病微生物气溶胶或出现溅出的操作均应在生物安全柜(Ⅱ级生物
安全柜为宜)或其他物理克制设备中进行，并使用个体防护设备。
2 解决高浓度或大容量感染性材料均必须在生物安全柜(Ⅱ级生物安全柜为宜)
或其他物理克制设备中进行，并使用个体防护设备。
上述材料的离心操作假如使用密封的离心机转子或安全离心杯，且它们只在生物
安全柜中开闭和装载感染性材料，则可在实验室中进行。
3 当微生物的操作不也许在生物安全柜内进行而必须采用外部操作时，为防
止感染性材料溅出或雾化危害，必须使用面部保护装置(护目镜、面罩、个体呼吸
保护用品或其他防溅出保护设备)。
4 在实验室中应穿着工作服或罩衫等防护服。离开实验室时，防护服必须脱
下并留在实验室内。不得穿着外出，更不能携带回家。用过的工作服应先在实验
室中消毒，然后统一洗涤或丢弃。
5 当手也许接触感染材料、污染的表面或设备时应戴手套。如也许发生感染
性材料的溢出或溅出，宜戴两副手套。不得戴着手套离开实验室。工作完全结束
后方可除去手套。一次性手套不得清洗和再次使用。

三级生物安全防护实验室

实验室结构和设施、安全操作规程、安全设备合用于

重要通过呼吸途径使人传染上严重的甚至是致死疾病

的致病微生物及其毒素，通常已有防止传染的疫苗。

例如：艾滋病病毒的研究(血清学实验除外)应在三级

生物安全防护实验室中进行。

例如：重症SARS病人传染性 较强，这与病人产生的大
量呼吸道飞沫有关。

三级生物安全防护实验室

1 实验室中必须安装Ⅱ级或Ⅱ级以上生物安全柜。

2 所有涉及感染性材料的操作应在生物安全柜中进行。当这类操作不得

不在生物安全柜外进行时，必须采用个体防护与使用物理克制设备的综合防

护措施。

3 在进行感染性组织培养、有也许产生感染性气溶胶的操作时，必须使

用个体防护设备。

4 当不能安全有效地将气溶胶限定在一定范围内时，应使用呼吸保护装

置。

5 工作人员在进入实验室工作区前，应在专用的更衣室(或缓冲间)穿着

背开式工作服或其他防护服。工作完毕必须脱下工作服，不得穿工作服离开

实验室。可再次使用的工作服必须先消毒后清洗。

6 工作时必须戴手套(两副为宜)。一次性手套必须先消毒后丢弃。

7 在实验室中必须配备有效的消毒剂、眼部清洗剂或生理盐水，且易于

取用。可配备应急药品。

四级生物安全防护实验室

实验室结构和设施、安全操作规程、安全设备合用于对人

体具有高度的危险性，通过气溶胶途径传播或传播途径不

明，目前尚无有效的疫苗或治疗方法的致病微生物及其毒

素。与上述情况类似的不明微生物，也必须在四级生物安

全防护实验室中进行。待有充足数据后再决定此种微生物

或毒素应在四级还是在较低档别的实验室中解决。

1 在实验室中所有感染性材料的操作都必须在Ⅲ级生物安全柜

中进行。假如工作人员穿着整体的由生命维持系统供气的正压工作

服，则相关操作可在Ⅱ级生物安全柜中进行。

2 所有工作人员进入实验室时都必须换上全套实验室服装，包

括内衣、内裤、衬衣或连衫裤、鞋和手套等。所有这些实验室保护

服在淋浴和离开实验室前均必须在更衣室内脱下。

(六) 培养细胞生长的条件

1 细胞的营养需要

2 细胞的生存环境

温度: 37 ℃，O2
CO2: 5%，CO2 +H2O ← →H2CO3 ← →H+ + HCO3-
pH: 7.2-7.4

3 无污染

4 无毒

1 细胞培养用液的配制

1）水：新鲜配置的三蒸水或去离子水

2）平衡盐溶液：无Ca2+、Mg2+的缓冲液，维持一定渗
透压和pH
PBS：NaCl 8.0 g
KCl 0.2 g
Na2HPO4.H2O 1.56 g

KH2PO4
加水至1000 ml
0.20

3）消化液：

·

·

·


胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健，除去细
胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架，从而使细胞分离。

胰蛋白酶是一种黄白色粉末，用无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液配制,
常用的胰蛋白酶液浓度是0.25％ 。用滤器过滤除菌。

胰蛋白酶液消化时间：2-10分钟。

4） 培 养 基 ：

·

·

·

·
·
·
·


培养基（培养液）是维持体外细胞生存和生长的溶液，分天然
培养基和合成培养基。

①天然培养基：

天然培养基有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸
液）。
优点：营养成分丰富，培养效果好
缺陷：来源受限
成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析。
易发生支原体污染

②合成培养基：

合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人
工方法模拟合成的。目前已设计出许多种培养基，如TC199、
MEM、RPMI-1640、 DMEM等。

合成培养基重要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无

机盐和其它一些辅助物质。

优点：标准化生产，组分和含量相对固定。成本低 。

缺陷： 缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。

人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁

殖，还需补充一定量的天然培养基（如血清）。

血清中具有：

①多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等） ；

②多种金属离子；

③激素；

④促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等；

⑤各种生长因子；

⑥转移蛋白；

⑦不明成分。

·

·

·


一般说来，含5％小牛血清的培养基对大多数细胞可以维

持细胞不死，但支持细胞生长一般需加10％血清．

血清中不仅存在促细胞生长因子，同对也存在细胞生长

克制因子或毒性因子，

因此在含血清培养基中培养的细胞所反映的生物学特性

是细胞和复杂血清因子的综合反映。

· ③无血清培养基:在基础培养基中补充各种必需因

子，如激素、生长因子 、结合蛋白 、贴壁和扩展

因子 等。

· 无血清培养基由基础培养基和替代血清的补充成

分组成。

·

无血清细胞培养基优点保证了实验结果的准确性、可反复

性和稳定性，减少了细胞污染，简化了提纯和鉴定各种细

胞产物的程序。

· 血清质量好坏是实验成败的关键。

· 常用血清有胎牛血洁、新生牛血清、小牛血清、

兔血清、马血清等，其中以胎牛血清质量最佳。

· 优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无

细菌、支原体、病毒污染。

· 血清的灭活（消除补体活性）：56 ℃ ，30 分钟

· 血清的消毒：过滤除菌

补体是热敏性的，是机体免疫防御系统的重要组成部分，
其重要功能是抗感染，补体虽然具有杀死病菌的作用，但
有时也伤害好细胞，引起炎症的作用。

· 抗菌素的使用：

·

·

·


在培养液配制后，培养液内常加适量抗菌素，以克制可

能存在的细菌的生长。

通常是青霉素和链霉素联合使用。培养基内青霉素、

链霉素最终使用浓度为每毫升100单位。

庆大霉素：每毫升100单位——方便、广谱、稳定。

④完全培养基的组成

·

·

·

·


基础培养基

血清

碳酸氢钠

青、链霉素


80％一95％

5％一20％

2.0 g/L

各100单位／毫升