塞内卡病毒实时荧光定量RT...PCR检测方法的建立及应用_周霞.pdf
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1、书书书动物医学进展,():研究论文塞内卡病毒实时荧光定量 检测方法的建立及应用收稿日期:基 金 项 目:广 东 省 农 业 科 学 院 协 同 创 新 中 心 项 目(和 );广 东 省 科 技 计 划 项 目();广东省现代农业岗位体系专家项目(和 )作者简介:周霞(),女,重庆大足人,博士研究生,主要从事预防兽医学研究;温肖会(),女,河南安阳人,副研究员,硕士研究生,主要从事动物疫病诊断与防控研究。同等贡献作者。通讯作者周霞,温肖会,赵亮,翟颀,吕殿红,罗胜军,贾春玲,周秀蓉,牛佳伟,陈天宝,贺东生,翟少伦,(广东省农业科学院动物卫生研究所广东省畜禽疫病防治研究重点实验室农业农村部兽用药
2、物与诊断技术广东科学观测实验站,广东广州 ;华南农业大学兽医学院广东省人兽共患病预防与控制重点实验室,广东广州 ;西藏农牧学院动物科学学院,西藏林芝 ;岭南现代农业科学与技术广东省实验室茂名分中心,广东茂名 )摘要:为加强塞内卡病毒()在不同宿主的诊断及流行病学监测与防控,根据 中发表的 基因区域设计一对特异性引物和带有 发光基团标记的探针,构建重组阳性质粒并用作建立实时荧光定量 方法的模板,对反应体系和条件进行优化,构建标准曲线并验证该方法的特异性、敏感性和重复性。结果显示,该方法的最适退火温度为 ,最佳引物和探针浓度分别为 和 ,最佳反应循环数为,值与标准品浓度的对数线性关系好。对猪源、鼠
3、源及牛源 和其他动物病毒(型口蹄疫病毒、水疱性口炎病毒、牛病毒性腹泻病毒、猪伪狂犬病病毒、边界病毒、猪库布病毒、牛库布病毒、山羊鼻内肿瘤病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛结节性皮肤病病毒、牛冠状病毒、型流感病毒、蓝舌病毒)的核酸检测结果显示,除猪源、鼠源及牛源 为阳性外,其他病毒核酸为阴性。该方法最低检测限为 拷贝,重复试验中组内和组间变异系数均小于。建立的检测多宿主 方法具有良好的特异性和稳定性,为 在不同宿主间的疾病诊断与流行病学调查或监控提供了快捷的方法。关键词:塞内卡病毒;探针;实时荧光定量 ;检测中图分类号:;文献标识码:文章编号:()型塞内卡病毒(,)因其发现地为塞内卡谷,故也称为塞内
4、卡谷病毒(,),该病毒属于小 病毒科塞内卡病毒属,病毒粒子无囊膜,基因组为单股正链。年,在细胞培养物中首次分离到该病毒,并命名为 。虽然能感染猪,但不能使猪致病。直到 年月,一批从加拿大进口到美国的猪群中有 的猪出现了跛行,部分猪鼻唇镜上出现溃疡,蹄甲出现大小不一的水疱,水疱破损,蹄甲脱落等临床症状,经检测 为阳性。此后,引起了全世界广泛的关注,美国、巴西、泰国、越南等国家均报道猪群感染 疫情。我国首例 感染疫情于 年在广东省报道,后续我国多地也相继有 感染发生。国内外研究报告,在猪场的鼠、苍蝇、料槽、运猪工具等采集的样品中都能检测到 核酸,且在牛血清里也检测到 抗体,提示 具有宿主多样性。本
5、 实 验 室 首 次 分 离 到 了 株 牛 源 ,并基于科赫法则证实了牛也是 的宿主。而 属于 病毒,具有易突变性,在不同的宿主体内其核苷酸均可以发生突变,因此建立一种可应用于临床检测多宿主 的检测方法,对不同物种间 的流行病学调查、监测及防控具DOI:10.16437/ki.1007-5038.2023.06.006有重要意义。材料与方法材料病毒和检测样品 型口蹄疫病毒(,)灭活疫苗核酸、水疱性口炎病毒(,)核酸、牛病毒性腹泻病毒(,)核 酸、猪 伪 狂 犬 病 病 毒(,)核酸、边界病毒(,)核 酸、猪 库 布 病 毒(,)核酸、牛库布病毒(,)核酸、山羊鼻内肿瘤病毒(,)核酸、牛传染性
6、鼻气管 炎 病 毒(,)核酸、牛结节性皮肤病病毒(,)核 酸、牛 冠 状 病 毒(,)核酸、型流感病毒(,)核 酸、蓝 舌 病 毒(,)核酸以及猪源、牛源、鼠源 样品,保存于广东省农业科学院动物卫生研究所畜禽疫病防治研究重点实验室。主要试剂 体液病毒 小量试剂盒,爱思进生物技术(杭州)有限公司产品;,.感 受 态,标 准 、质粒小量制备试剂盒和 纯化回收试剂盒,宝生物工程(大连)有限公司产品;高纯度质粒小提中量试剂盒,天根生化科技(北京)有限公司产品;一步法荧光 反应试剂,南京诺唯赞生物科技有限公司产品。主要仪器设备梯度 扩增仪,杭州博日科技有限公司产品;电泳仪装置,凝胶成像系统,上海天能科技
7、有限公司产品;实时荧光定量 仪,德国耶拿公司产品。方法引物设计及合成引物序列根据毒株 (:)序列的 基因部分经过 分析,设计一对引物和探针序列并由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,引物及探针序列见表。标准品质粒制备将 目的片段连接 载体,转化至.感受态细胞扩大培养阳性质粒,提取质粒进行测序鉴定,将鉴定正确的质粒用作制作标准曲线的模板。实时荧光定量 将制备的标准品质粒模板使用分光光度计测定浓度,将标准品 倍倍比稀释,依次稀释至 倍。使用一步法荧光 反应试剂盒优化退火温度、引物浓度、反应循环数,以获得合适的反应体系和程序。表基于 基因的 引物及探针序列 引物 序列()长度 :标准曲线建立选取重
8、组阳性质粒 (拷贝)为模板,进行 倍倍比稀释(拷贝,个梯度),每个浓度设置个重复,并设置阴性对照。特异性试验以 、核酸为检测对象,猪源、牛源、鼠源 样品提取核酸为阳性对照,以去离子水作为阴性对照,用所建立的一步法荧光 方法进行检测,同时设置空白对照,以检测其特异性。敏感性试验选取重组阳性质粒 (拷贝)为模板,进行 倍倍比稀释(拷贝,个梯度),按照本研究所建立的一步法荧光 方法进行检测,同时设阴性对照,来检测该方法的敏感性。重复性试验选择个不同浓度的阳性重组质粒 (、拷贝)按照建立的一步法荧光 方法分别进行批内和批间重复性试验,对该方法的重复性进行评价。批内试验每个样本设置个重复,批间试验分次进
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